基于氫核磁共振技術和化學計量學方法鑒別蜂蜜品種

宋曉瑩，陳蘭珍,2,3*，李 熠,2,3，周金慧,2,3，陳 雷，辛曼曼

(1.中國農業科學院 蜜蜂研究所，北京 100093；2.農業農村部 蜂產品質量安全控制重點實驗室，北京 100093；3.農業農村部 蜂產品質量安全風險評估實驗室,北京 100093；4.中國科學院武漢物理與數學研究所，湖北 武漢 430071)

蜂蜜的物質組成復雜，其主要成分是糖類，占蜂蜜成分的65%～80%，糖類中又以葡萄糖和果糖為主。此外，還有18%～22%的水，少量的蛋白質、酶、游離氨基酸、黃酮類物質、酚酸類物質、礦物元素以及微量元素[1]。常見的蜂蜜品種是按照蜜蜂所采集的蜜源植物不同進行劃分。我國地域遼闊，蜜源植物種類較多，能得到的商品蜜種類多達幾十種。因此，還衍生出其他劃分蜂蜜品種的方式，如根據蜂蜜的顏色可劃分為淺色蜜和深色蜜，市面上常見的洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜、椴樹蜜為淺色蜜，棗花蜜、蕎麥蜜為深色蜜。

蜂蜜作為一種藥食同源的食品，近年來的市場需求量不斷增加。由于不同蜜源植物來源的蜂蜜品質及感官特征不同[2]，因此在市場中，不同品種蜂蜜的價格差異較大，且以淺色蜜更受歡迎[3]。但不同種蜂蜜的主要成分含量差別很小，傳統方法很難鑒別蜂蜜品種，因此出現了低價蜜摻入高價蜜中進行銷售的現象，造成蜂蜜品種標識混淆，市場價格混亂[4]，并已成為蜂蜜市場中一個比較突出的問題。

蜂蜜品種的傳統檢測方法是感官鑒別和花粉分析，其結果判斷帶有一定的主觀性，需要實驗員具有豐富的經驗和專業的知識背景[5-6]。近年，一些檢測技術也被應用于蜂蜜品種鑒別中，主要包括高效液相色譜[7]、液相色譜-質譜聯用技術[8]、氣相色譜-質譜聯用技術[9]、光譜技術(如近紅外光譜、中紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜)[10-13]、電感耦合等離子體質譜[14]等。這些方法均有各自的優缺點，尚未有一種檢測技術能夠有效地鑒別不同品種的蜂蜜。

氫核磁共振技術(1H NMR)是依靠核磁共振現象測定分子結構的一種譜學技術，通過對樣本施加外加磁場，使處在低能態的自旋核發生躍遷到高能態，當自旋核發生弛豫返回低能態時，產生核磁共振信號[15]。該技術一次進樣就可檢出樣品中所有含氫的化合物，檢測物質的覆蓋面廣，樣本預處理簡單，上機分析所需時間較短。近年來，1H NMR被廣泛應用到食品領域，并在牛奶[16]、橄欖油[17]、酒類[18]的品種鑒別以及咖啡[19]、牛奶[20]的產地識別中取得了很好的成果。現階段，該方法在蜂蜜品種鑒別領域中的應用較少。本研究采用1H NMR對洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜進行全譜圖分析，結合化學計量學的方法，以期從整體物質角度，建立最佳的判別分析模型，從而為解決蜂蜜品種的鑒別提供行之有效的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AVANCE 600MHz液體NMR儀(瑞士 Bruker 公司)；PL103電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)：移液槍(德國 Eppendorf 公司)；1-15PK臺式高速離心機(德國 Sigma 公司)；5 mm 核磁管(美國 Norell 公司)；渦旋混合器(美國 Scientific Industries 公司)。

三水合磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)購自上海國藥集團試劑有限公司；重水(D2O，99.9%氘代，含0.05 g/100 mL 2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸(TSP)，美國 Cambridge Isotope Laboratories公司)。

1.2 樣品信息

實驗選擇的蜂蜜品種為洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜，均為較受市場歡迎的淺色蜜。所有的蜂蜜樣品均直接取自蜂場中自然釀造的成熟蜜。共收集144個樣品，在4 ℃的冰箱中貯藏、備用。蜂蜜樣本的具體信息如表1所示。

表1 蜂蜜樣本的信息Table 1 The information of honey samples

1.3 NMR樣品的制備

將蜂蜜從冰箱中取出，放置至室溫。對有結晶的樣品，在60 ℃水浴加熱，待樣品完全溶解后再稱樣。稱取蜂蜜100.00 mg置于離心管中，加入1.2 mL pH 7.4的磷酸緩沖液(0.15 mol/L K2HPO4/ NaH2PO4,使用含10% D2O 的雙蒸水配制而成)后，在渦旋振蕩器上振蕩5 min，直至樣品混合均勻。在8 000 r/min下離心10 min,取600 μL上清液轉至5 mm 核磁管中。

1.4 數據采集與處理

在600 MHz液體NMR儀上，采用NOESYPR1D脈沖序列(Recycle delay-90°-t1-90°-tm-90°-acquisition)采集樣品信息，序列中90°脈沖的脈寬為14.5 μs，固定間隔t1為4 μs，混合時間tm為2.27 s，實驗溫度設置為298 K。采用預飽和方法進行水峰抑制，持續2.0 s。1H NMR的譜寬設為 12 000 Hz，采樣點數為32 768，信號累加次數為64次。所有得到的自由感應衰減信號經過指數加權和傅里葉變化(指數線寬因子為0.3 Hz)后得到核磁共振的一維圖譜。

對得到的1H NMR譜圖進行處理，手動調節基線、相位，對化學位移定標,將內標TSP的共振峰設為δ0.00。將處理好的NMR譜圖按照每段寬度為δ0.004進行分段積分，為消除殘留水信號的影響，剔除δ4.73～4.93區間的信號。為減少不同組分和樣品間的差異，對信號峰的峰面積進行歸一化處理，所得到的積分數據導入Excel文件中保存。采用SIMCA 13.0 軟件(v13.0,Umetrics.,Sweden)進行數據分析。

圖1 洋槐蜜(A)、油菜蜜(R)、荔枝蜜(L)的1H NMR譜圖Fig.1 1H NMR spectra of acacia honey(A),rape honey(R) and lychee honey(L)1.formic acid(甲酸),2.phenylalanine(苯丙氨酸), 3.tyrosine(酪氨酸),4.kojibiose(曲二糖), 5.sucrose(蔗糖),6.nigerose(黑曲霉糖), 7.turanose(松二糖),8.α-glucose(α-葡萄糖),9.citric acid(檸檬酸),10.succinic acid(琥珀酸),11.proline(脯氨酸), 12.acetic acid(乙酸),13.alanine(丙氨酸),14.lactic acid(乳酸), 15.3-hydroxy-butanone(3-羥基丁酮),16.ethyl acetate(乙酸乙酯), 17.ethanol(乙醇),18.2,3-bu-tandiol(2,3-丁二醇), 19.valine(纈氨酸)

2 結果與討論

2.1 譜圖解析

選取洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜的核磁譜圖進行對比，發現不同品種蜂蜜的譜圖無明顯差異。蜂蜜的1H NMR 譜圖可以分為3部分：脂肪區(δ0.0～3.0)，糖類化合物區(δ3.0～6.0)，芳香區(δ6.0～9.5)。通過局部放大3個區域的主要信號峰區間(圖1)，對其中的信號峰進行鑒別，并結合化學位移、耦合常數、峰形等信息，查閱相關參考文獻對信號峰進行歸屬后，共鑒定出19種化合物[21-23]。

在脂肪區主要集中有機酸、氨基酸以及醇類物質的信號峰。在糖類化合物區域，有效信號主要集中在δ5.0～5.5，集中著單糖和二糖信號。在芳香區中，可鑒別出苯丙氨酸、酪氨酸、甲酸3種物質中苯環上氫質子的共振信號。

2.2 數據分析

在蜂蜜中,葡萄糖、果糖等單糖含量較高，與丙氨酸等含量低的物質在含量上可以相差數個數量級，因此在后續進行多變量統計分析時，信號較弱的成分含量變化會被信號較強的成分含量變化所掩蓋，進而影響差異成分的識別。為了避免上述情況出現，在建模前需對數據進行優化。常見的數據預處理方法包括：中心化(Mean center scaling,Ctr)、自標度化(Unit variance scaling,UV)、帕萊托標準化(Pareto scaling,Par)。Ctr 處理是將數據集中的各項數據減去其均值，既不會改變樣本點之間的相對位置，也不會促使變量間相關性發生改變，能夠更好地分析數據集中波動的部分，但可能導致低含量的變量信息受到高含量變量信息的抑制[24]。UV處理可使新得到的每個變量的均值或標準差在同一個等級上，但噪聲信號區域可能會影響最終結果[25]。在Par處理中，中心化和尺度變化同時進行,通過對每個變量賦予相同的縮放系數，可有效地減少較大信號數據的相對重要性，保留原始數據集結構的完整性，但變化相對較小的重要變量無法被選定為標記物[26]。因此，3種方法各有優缺點，在實際分析中需根據具體的數據進行篩選。

在SMICA軟件中，常見的評價模型質量的參數有R2X、R2Y和Q2，其中R2X、R2Y分別代表模型對數據矩陣的解釋能力，Q2代表模型整體的預測能力。通常情況下，R2和Q2值越接近1，則說明模越穩定可靠，該值大于0.5就證明模型的判別效果較好。

表2 PLS-DA模型在不同數據預處理下的模型參數Table 2 Model parameters of PLS-DA model under different data scaling methods

圖2 PLS-DA在UV預處理下的得分散點圖Fig.2 Score scatter plot of PLS-DA with UV scaling

MethodR2X(cum)R2Y(cum)Q2(cum)Ctr0.7690.5260.471UV0.6320.9580.905Par0.6850.6940.607

圖3 OPLS-DA在UV預處理下的得分散點圖Fig.3 Score scatter plot of OPLS-DA with UV scaling

2.2.1偏最小二乘判別分析偏最小二乘判別分析(PLS-DA)是一種常見的有監督的模式識別方法，是在主成分分析的基礎上增加了一個隱形變量(Y)，使自變量向Y回歸的程度達到最大，以此弱化組內之間的差異，突出組間的差異[27]。

分別在3種預處理條件下建立PLS-DA模型，3個模型中的參數見表2。通過參數對比，發現在UV模式下模型的判別效果最好。在此條件下建立PLS-DA模型，該模型中前8個主成分的累積貢獻率R2Y已近95%，超過一般要求的累積貢獻率(85%)。根據模型的得分散點圖(圖2)可看出，荔枝蜜樣本主要集中在PC1得分值的負值區域，而洋槐蜜、油菜蜜樣本主要集中在PC1得分值的正值區域；油菜蜜樣本主要集中在PC2得分值的正值區域，洋槐蜜樣本主要集中在PC2得分值的負值區域。3種蜂蜜之間有著明顯的分離趨勢，但仍然存在過重合的現象，需選擇更為合適的判別模型。

2.2.2正交偏最小二乘判別分析為了進一步去除不相關的差異，更好地進行判別分離，在PLS-DA 基礎上結合正交信號，去除與Y矩陣無關的X矩陣的變化，使得X矩陣和Y矩陣之間的關系最大化，將分組差異最大化[28]。因此，采用正交偏最小二乘判別法(OPLS-DA法)進一步分析、比較不同品種蜂蜜之間的差異。

分別在3種預處理條件下建立OPLS-DA模型，通過對比同模型的特征參數值(表3)，發現在UV模式下，模型的R2Y和Q2值均最高，因此選擇UV作為建模時的數據預處理方式。根據OPLS-DA模型得分圖(圖3)，發現在第二主成分下，3種蜂蜜可以得到很好的判別分離，油菜蜜主要集中在PC2得分值的正值區域，荔枝蜜處在坐標的中心區域，而洋槐蜜主要分布在PC2得分值的負值區域。

利用OPLS-DA模型可以有效地區分洋槐蜜、油菜蜜和荔枝蜜，所建模型對3種蜂蜜的判別解釋能力達95.8%，對未知樣本的預測能力為90.5%。

3 結 論

本文采用1H NMR結合化學計量學的方法進行蜂蜜品種的鑒別。通過對不同品種蜂蜜的主要核磁信號峰進行歸屬，共鑒定出19種化合物的特征峰。為了更好地挖掘核磁數據中的信息，討論了在建立判別模型中數據預處理的方法，通過比較發現自標度化為最適合核磁數據建模的數據預處理方式。通過不斷篩選合適的數據分析模型，發現在自標度化處理下，利用OPLS-DA模型可以很好地區分洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜。本文所采用的1H NMR是基于蜂蜜的全組分分析方法，能夠獲得樣品的全部有效信息，有效彌補了其他檢測技術對檢出物質化學鍵、官能團的限制。將1H NMR與OPLS-DA相結合，能夠快速、準確地區分不同品種的蜂蜜，從而為規范蜂蜜市場提供了一種新方法。