共價有機籠CC3-R毛細管電色譜柱用于拆分扁桃酸化合物的研究

田春容，朱鵬靜，呂 云，何宇雨，字 敏，袁黎明

(云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500)

手性分離一直都是學術界研究的熱門課題之一，受到人們的高度關注，隨著藥物手性和藥效關系的深入研究，人們越來越意識到手性藥物的臨床意義。含手性的臨床用藥超過50%，其中85%以上以外消旋體形式存在。扁桃酸是手性藥物中廣泛使用的化學中間體，可合成環扁桃酯(血管擴張劑)、扁桃酸芐酯(鎮痙劑)以及烏洛托品(尿路消毒劑)等藥物。因此研究扁桃酸的手性拆分對生物不對稱合成及單一對映體的藥理和藥效具有重要意義[1]。

多孔有機分子籠(POC)是一種通過弱分子間作用力堆積自組裝形成的具有永久性空腔的三維籠狀有機分子，是多孔材料的一種，因具有比表面積高、骨架密度低、化學穩定性和熱穩定性良好等特點，而在氣體吸附與存儲、分離、分子識別、傳感、催化等領域有著潛在的應用價值和廣闊的應用前景，近幾年來迅速成為研究熱點[2-3]。Cooper等[4]在Gawronski的基礎上對合成的晶體進行了深入研究，不僅給出了單晶數據還報道了一系列類似亞胺的POC材料，這些POC材料均由1,3,5-均苯三甲醛或者1,3,5-三(4-苯甲?；?苯或三(4-甲酰苯基)胺和一些二胺經過席夫堿環縮合反應而制成的籠型分子。POC材料在普通有機溶劑中具有良好的溶解性，且揮干溶劑后不會改變其本身結構和性質，非常適合用作毛細管色譜的固定相。2015年,本課題組申請的中國專利[5]首次證實了手性POC材料可用作氣相色譜固定相，對分離手性化合物具有較高的選擇性、較好的穩定性及重現性。隨后，POC材料在氣相色譜手性分離中的應用得到進一步發展，如CC3[6]、CC9[7]和CC10[8]等POC材料被開發出來用作氣相色譜的固定相，其中，CC3晶體已被用于有機合金[9]、膜[10]、氣體吸附[11]和毛細管電色譜[12]等研究領域。本文將CC3-R晶體用作毛細管電色譜手性固定相制備了開管毛細管柱，并以其對扁桃酸進行了拆分，分離度達1.81。表明手性CC3-R作為一種新型的毛細管電色譜手性固定相具有良好的應用前景。

1 實驗部分

1.1 試劑、儀器與材料

1,3,5-均苯三甲酸、三氟乙酸(TFA)、氯鉻酸吡啶鎓(PCC)、四氫化鋁鋰(LiAlH4)和(R,R)-1,2-環己二胺購于日本TCI公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)購于阿達瑪斯試劑公司；鹽酸、氫氧化鈉、二氯甲烷和磷酸購于天津風船化學試劑公司；扁桃酸購于美國Sigma-Aldrich試劑公司。所用試劑均為分析純及以上。彈性石英毛細管(75 μm內徑)由銳灃色譜器件有限公司提供(河北永年公司)。HP-β-CD-Tris緩沖液：取0.12 mol/L HP-β-CD溶液加入異丙醇-100 mmol/L Tris溶液(體積比18 ∶ 82)中，再用磷酸調至pH 7.6。毛細管電色譜實驗均在CL1020高效毛細管電泳儀(北京華陽利民儀器有限公司)上完成。

1.2 CC3-R晶體的合成

參照文獻[13-14]合成CC3-R晶體。具體步驟：取20 mL二氯甲烷和20 μL三氟乙酸緩慢加入含有1.0 g 1,3,5-均苯三甲醛的圓底燒瓶中，靜置5 min，加入20 mL溶有1.0 g (R,R)-1,2-環己二胺的二氯甲烷溶液，室溫下密封反應72 h，待燒瓶內壁有晶體生成后用G4 60 mL砂芯漏斗過濾，再用乙醇-二氯甲烷(體積比95 ∶ 5)洗滌，最后于50 ℃下干燥得1.2 g CC3-R固體產物，產率約為32%。

1.3 毛細管預處理

毛細管使用前，需進行內壁粗糙化處理：取內徑為75 μm的彈性石英毛細管先用1 mol·L-1NaOH溶液沖洗2 h，再用蒸餾水沖洗0.5 h，接著用0.1 mol·L-1的HCl溶液沖洗1 h，中和殘留的NaOH，再用去離子水沖洗至中性，最后連接在氣相色譜儀上用N2于110 ℃下吹干備用[15]。

1.4 CC3-R毛細管柱的制備

本實驗所用毛細管柱采用靜態涂敷制作：將CC3-R溶于CH2Cl2中配成5 mg·mL-1的溶液，超聲脫氣，再將上述溶液抽入毛細管柱中，待其充滿整根毛細管柱后密封住其中一端，將另一端與真空瓶連接，使二氯甲烷在36 ℃水浴條件下揮干，此時，CC3-R已涂敷在毛細管的內壁表面，然后對柱子進行老化處理，即得CC3-R色譜柱[16]。

1.5 毛細管電色譜條件

取一根制備好的長為55 cm(內徑為75 μm)的CC3-R毛細管柱，在距離末端8 cm處燒掉大約5 mm的毛細管外壁涂層，用以制作檢測窗口，毛細管的有效長度(從進樣端口至檢測窗口處)為45 cm，放入高效毛細管電泳儀內。涂覆的開管柱在首次使用前均預先用去離子水和HP-β-CD-Tris緩沖液液(使用前需超聲脫氣處理)分別沖洗10 min，直至運行獲得穩定的基線。實驗中以硫脲為電滲流標記物[17]。所有毛細管柱在每次連續進樣之間均需用去離子水和HP-β-CD-Tris沖洗3 min。本實驗所有操作均在室溫下進行，進樣方式為虹吸進樣，進樣高差約為10 cm，進樣時間為10 s，紫外檢測波長為254 nm。

實驗結果中的分離因子a=t2/t1，分離度Rs=1.18(t2-t1)/(W1/2(1)+W1/2(2))，理論塔板數N=5.54(tR/W1/2)2/L；其中t1和t2分別為2個對映體的遷移時間(min)，W1/2(1)和W1/2(2)分別為兩個對映體的半峰寬(min)，L為色譜柱的有效長度(m)，tR為對映體的遷移時間(min)，W1/2為對映體的半峰寬(min)[18]。

圖1 CC3-R晶體粉末的XRD衍射圖Fig.1 XRD diffraction patterns of CC3-R crystal powdera.simulated；b.the XRD diagram synthesized by experiment；c.the XRD diagram immersed in HP-β-CD-Tris buffe solution for 24 h

2 結果與討論

2.1 CC3-R晶體的表征

CC3-R晶體粉末的XRD衍射圖見圖1，由圖可見，實驗制得的晶體XRD圖(曲線b)與文獻晶體數據模擬的XRD(曲線a)[13]能夠非常好地吻合在一起，表明實驗所合成的CC3-R晶體與文獻一致。將制備的CC3-R晶體在HP-β-CD-Tris緩沖溶液中浸泡24 h，揮干溶劑后重新析出晶體，再進行XRD測試(曲線c)，發現衍射峰位置與浸泡前完全一致，表明CC3-R晶體在HP-β-CD-Tris緩沖液中穩定性良好，可進行下一步電色譜實驗。

對CC3-R晶體進行熱重分析考察其熱穩定性，發現300 ℃以內該化合物能夠穩定存在，不會發生分解或改變，因此制柱的老化處理過程不會對CC3-R晶體的結構產生影響。

2.2 CC3-R涂覆毛細管柱電鏡圖

實驗考察了毛細管內壁中CC3-R晶體的涂覆情況，將涂好的毛細管柱截取大約0.5 cm，進行SEM分析(圖2)。由圖可見，CC3-R已成功涂覆在毛細管內壁上，膜厚大約為80 nm，且涂覆效果良好。

2.3 CC3-R涂覆毛細管柱電滲流的表征

對實驗制備的CC3-R涂覆毛細管柱進行了性能測評，考察了電壓對電流值的影響。結果顯示，當電壓以2 kV為單位梯度由8 kV增至20 kV時，電流隨電壓線性增大，相關系數為0.995 8，表明該毛細管柱在此條件下的柱內焦耳熱效應較小，可在大范圍內選擇分離電壓。

實驗還比較了pH值(3.5～8.5)對空白毛細管柱和CC3-R涂覆毛細管柱的影響，結果顯示，2種毛細管中的電滲流均隨pH值的增大而增大，變化趨勢相似，但空白柱的電滲流明顯大于CC3-R柱，可能是由于當pH值大于3.0時，空白柱毛細管石英內壁的硅羥基開始解離,且解離程度隨著pH值的增大也越來越大，從而導致電滲流逐漸增大。而涂覆過的開管柱則因表面覆蓋了CC3-R，電滲流的增大不如空白柱，進一步表明CC3-R晶體已經成功地涂覆在毛細管內壁，同時也說明該晶體自身不產生或僅產生微小的電滲流。

圖3 扁桃酸在涂覆柱上的分離電色譜圖Fig.3 Separation of mandelic acid on coated column HP-β-CD-Tris buffer solution(pH 7.6)；separation voltage：15 kV；sample injection：10 cm height difference 15 s；UV detection wavelength：254 nm

2.4 CC3-R涂覆毛細管柱對扁桃酸的拆分

實驗考察了CC3-R涂覆毛細管柱對手性化合物的拆分能力，選擇在HP-β-CD-Tris緩沖液中對扁桃酸進行手性拆分。結果顯示,D-扁桃酸和L-扁桃酸在CC3-R涂覆柱得到良好的基線分離，分離度為1.81，理論塔板數分別為36 700 N/m和41 600 N/m，色譜譜圖見圖3。

色譜手性分離研究中，由于固定相微觀環境對手性識別影響十分復雜，且多孔有機籠在手性電色譜分離研究中尚處于起步階段，對其在色譜手性分離中的研究報道也較少，因此難以確定多孔有機籠在毛細管開管柱中的手性識別機理。本實驗合成的CC3-R是一種具有類似四面體構型的籠狀分子，每一個籠分子都具有手性，籠的中央具有一個空腔，空腔周圍有4個類似三角形的孔窗口，相鄰的籠分子之間通過窗-對-窗的方式堆積自組裝形成一種多孔分子晶體，且形成的通道與每個孔窗口相互貫通(圖4)。此時分析物與CC3-R中手性通道及分子內空腔之間的主-客體包合和立體構型匹配作用可能會對手性分離產生至關重要的作用[12]。據此推測，手性識別的效果很可能與此晶體特殊的微觀結構相關。除此之外，流動相和固定相中各分子間作用力也會對手性分離起到一定作用。

圖5 不同長度CC3-R涂敷毛細管對扁桃酸的分離譜圖Fig.5 Separation of mandelic acid by capillary coated with CC3-R with different lengthsa.65 cm,b.55 cm,c.45 cm

2.5 重現性及穩定性評價

穩定性和重現性是評價毛細管電色譜的重要指標，為測試CC3-R涂覆毛細管柱的穩定性和重現性，在HP-β-CD-Tris緩沖液中，于15 kV運行電壓下，連續進樣5次扁桃酸，計算得其保留時間的相對標準偏差(RSD)為1.2%；另取3根長度分別為45、55、65 cm的CC3-R涂敷毛細管柱考察對扁桃酸的分離情況，發現均能實現扁桃酸的基線分離，分離度分別為1.90、1.81、1.72，但出峰時間不同(圖5)。

3 結 論

本文合成了一種具有永久性三維鉆石網狀通道的單一手性多孔有機分子籠材料(CC3-R)，將其作為開管毛細管電色譜柱的固定相，并進行毛細管電色譜分離實驗，發現其對手性化合物扁桃酸具有較好的識別性能，且穩定性和重現性良好。本研究預示著多孔有機籠材料有望在不久的未來成為一種新型固定相被用于分析領域。