辣根過氧化物酶直接電化學傳感器檢測過氧化物的研究

曹 嬙，楊紹明，楊 杰，張小榮，柏朝朋，滕 渝

(華東交通大學 材料學院，江西 南昌 330013)

過氧化物廣泛應用于化工、造紙、醫藥等領域，對人們的生產生活造成很大影響[1-2]，如過氧化氫異丙苯溶于水后，不僅污染環境，若被生物體吸入，則會引起中毒，破壞正常的生物機理，阻礙正常的生物代謝[3]。目前，過氧化物檢測的方法主要有分光光度法[4]、化學發光法[5]、熒光法[6]和酶傳感器法[7-8]等，而基于辣根過氧化物酶的電化學傳感器法，以靈敏度高、選擇性好和儀器設備簡單等優點，受到廣大研究者的密切關注。辣根過氧化物酶電化學傳感器檢測過氧化物一般通過電子介體的中介作用，或酶的直接電化學法實現酶與電極之間的電子傳遞。直接電化學法的酶傳感器法無需電子介體，可簡化電極制備，但由于酶的電活性中心被蛋白質本體包覆，一般難以實現與電極之間的直接電化學。因此，納米材料如碳納米管[9]、石墨烯[10]、金納米粒子[11]及復合納米材料[12]等常被用來修飾電極表面以促進酶與電極之間的電子傳遞。如Yagati等[13]先將石墨烯/金納米粒子復合物修飾到氧化銦錫(ITO)電極表面，然后通過共價鍵合將辣根過氧化物酶(HRP)固定到電極表面，實現酶直接電化學檢測過氧化氫。

基于復合納米材料的直接電化學HRP傳感器的制備存在納米材料的修飾與酶的固定化需分步完成及靈敏度較低等問題。本文以高比表面積和導電性好的泡沫鎳(Ni foam)為基底材料，在碳納米管(CNTs)修飾的泡沫鎳表面，一步電沉積法制備了HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam。首先，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的表面活性劑作用使金在電極上形成納米結構；其次，HRP在偏堿性溶液中帶負電，CTAB通過吸附作用，在AuNPs的沉積過程中將其固定在電極上，制備了辣根過氧化物酶生物傳感器。一步法制備的AuNPs-HRP使HRP與納米材料充分接觸，縮短了酶活性中心與電極表面的距離，為酶與電極之間的直接電子傳遞作用提供了良好的環境。該生物傳感器可實現對過氧化氫、2-過氧化丁酮、過氧化氫異丙苯的靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；JSM-6701F場發射型掃描電鏡(日本電子JEOL公司)；氯金酸(HAuCl4，分析純，上海試劑一廠)；碳納米管(CNTs，≥97%，深圳納米港有限公司)；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，分析純，上海展云化工有限公司)；辣根過氧化物酶(HRP，250 U/mg，上海三杰生物技術有限公司)；30%過氧化氫(西隴化工股份有限公司)；過氧化氫異丙苯(化學純，國藥集團化學試劑有限公司)；2-過氧化丁酮(分析純，阿拉丁試劑有限公司)。

1.2 修飾電極的制備

按照文獻[14]制備羧基化的多壁碳納米管；然后將處理后的Ni foam(先用丙酮除油，再進行醇洗、水洗)置于1 mg/mL碳納米管溶液中于-0.9 V恒電位沉積20 min，用去離子水清洗表面得CNTs/Ni foam修飾電極，再將該修飾電極置于2 mmol/L HAuCl4、10 mmol/L CTAB、3 mg/mL HRP的混合溶液(pH 7.5 磷酸緩沖溶液(PBS))中于-0.9 V恒電位下電沉積30 min，最后用去離子水淋洗，除去電極表面未牢固的粒子和酶，得到HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam修飾電極，于4 ℃的冰箱中保存，備用。

1.3 電化學測定

本文所有電化學測試均在CHI660E電化學工作站進行，三電極體系：以修飾電極為工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)為參比電極，鉑電極為對電極。

循環伏安(CV)曲線：于0.2 mol/L的PBS底液中以50 mV/s的速率獲得CV曲線。

電化學交流阻抗(EIS)：于5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1 ∶ 1)溶液中以振幅為0.005 V，在1～100 000 Hz頻率范圍內，測定得到電化字阻抗譜，并通過ZSimpwin軟件模擬而成。

電流～時間(I～t)曲線：以0.2 mol/L PBS為底液，在一定電位條件下，連續滴加一定濃度的過氧化氫、2-過氧化丁酮、過氧化氫異丙苯得到。

2 結果與討論

2.1 AuNPs/CNTs/Ni foam、HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam的掃描電鏡(SEM)及能譜表征

AuNPs/CNTs/Ni foam和HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam的SEM圖見圖1，由圖可見，無HRP存在時，沉積在電極表面碳納米管表面的AuNPs分散均勻，且金納米粒子直徑小，約為十幾個納米(圖1A)；修飾HRP后，由于HRP與AuNPs共沉積到碳納米管表面，碳納米管的尺寸明顯變大(圖1B)；另外，HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam的能譜圖(圖1C)中可見Ni、C、O和Au元素，表明HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam已成功制備。

圖1 AuNPs/CNTs/Ni foam(A)和HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam(B)的SEM圖以及HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam的能譜圖(C)Fig.1 SEMs of AuNPs/CNTs/Ni foam(A),HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam(B)and EDS of HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam(C)

2.2 修飾電極的電化學性質

Ni foam、CNTs/Ni foam以及HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1 ∶ 1)溶液中的電化學交流阻抗圖見圖2A，由圖可見，在Ni foam(曲線a)電極表面電沉積一層CNTs后(曲線b)，半圓直徑變小，阻抗變小，表明CNTs的優良電子傳導性能有效促進了[Fe(CN)6]4-/3-在電極表面的電子傳遞；再修飾HRP后，電極的阻抗明顯增加，已大于Ni foam，進一步說明HRP已成功修飾到電極表面。

采用循環伏安法考察了HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam修飾電極對過氧化氫的催化行為(圖2B)，結果顯示,HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam在pH 7.0 PBS緩沖溶液中出現一對可逆的氧化還原峰，這是HRP輔基血紅素中的Fe(Ⅱ)/Fe(Ⅲ)氧化還原所產生的可逆峰[15]。向其中加入50 μmol/L過氧化氫后，體系的還原峰電流增大，氧化峰電流減小，出現了明顯的催化還原特征，表明該修飾電極對過氧化氫產生了催化。

圖3 不同修飾電極對連續滴過氧化氫(40 μmol/L)的時間～電流曲線Fig.3 I-t curves of the different electrodes on successive addition of 40 μmol/L H2O2a.Ni foam,b.CNTs/Ni foam,c.AuNPs/CNTs/Ni foam, d.HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam;applied potential:-0.3 V

為進一步考察HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam對過氧化物的催化響應，分別將Ni foam、CNTs/Ni foam、AuNPs/CNTs/Ni foam、HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam 4種修飾電極于pH 7.0 PBS緩沖溶液中連續滴加40 μmol/L過氧化氫，考察其電流～時間響應(圖3)。結果顯示，Ni foam和CNTs/Ni foam對過氧化氫具有微小的催化作用，AuNPs/CNTs/Ni foam對過氧化氫的催化能力在金納米粒子的作用下有所提升，而HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam電極對過氧化氫的催化作用非常明顯，說明HRP的加入顯著提高了修飾電極的催化性能，該HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam修飾電極可用于過氧化氫檢測。

2.3 實驗條件的優化

由于pH值對酶催化作用有較大影響，因此，實驗以20 μmol/L過氧化氫為例，考察了測定底液的pH值(6.0～8.0)對HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam電流響應的影響。結果顯示，當測試底液pH值從6.0增至8.0時，修飾電極對過氧化氫的電流響應呈先增大后減小的趨勢，且在pH 7.0時達最大值，表明此時修飾電極性能最好，酶催化效果最強，所以選擇測試底液的pH值為7.0。

由于工作電位對修飾電極的性能也有較大影響，因此，實驗在pH 7.0的PBS緩沖溶液中，采用電流～時間法考察了HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam在不同工作電位(-0.15～-0.45 V)下對20 μmol/L過氧化氫的電化學響應情況。結果顯示，在-0.15～-0.45 V工作電位范圍內，響應電流呈先增加后降低的趨勢，且在-0.3 V處達到最大值，因此選擇-0.3 V為工作電位。

2.4 HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam對過氧化物的分析檢測

在優化條件下，采用電流～時間曲線考察了不同濃度的過氧化氫(2.5×10-7～5.4×10-4mol/L)、過氧化氫異丙苯(8.8×10-7～1.5×10-3mol/L)、2-過氧化丁酮(6.8×10-7～1.2×10-3mol/L)在HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam電極上于0.2 mol/L PBS(pH 7.0)緩沖溶液中的電流響應。結果顯示，過氧化氫、過氧化氫異丙苯、2-過氧化丁酮的電流值(I,A)隨其濃度(c,mol/L)的增加而增大，且在相關濃度范圍內呈良好的線性關系，線性方程分別為I=2.5×10-4+2.6c(r=0.999)、I=3.7×10-4+1.2c(r=0.998)、I=3.1×10-4+1.6c(r=0.998)，修飾電極的檢測靈敏度依次為2.6、1.2、1.6 A·L/mol，根據空白的標準偏差計算得三者檢出限分別為1.2×10-7、4.5×10-7、2.5×10-7mol/L。

由于本文采用高比表面積的泡沫鎳為基礎電極，又結合了碳納米管和納米金的優異電化學特性，且采用一步法制備AuNPs-HRP使HRP與納米材料充分接觸，縮短了酶活性中心與電極表面的距離，為酶與電極之間的直接電子傳遞作用提供了良好的環境，使該傳感器檢測過氧化氫的靈敏度優于文獻(表1)。

表1 HRP傳感器直接電化學檢測過氧化氫的性能Table 1 Performances of direct electrochemistry HRP sensor for the detection of H2O2

圖4 修飾電極的抗干擾性能Fig.4 The anti-interference performance of modified electrode

2.5 抗干擾性能與回收率

實驗考察了甘氨酸(Gly)、抗壞血酸(Vc)、脲(Urea)、L-絡氨酸(L-Tyr)、葡萄糖(Glu)、凝血酶(Thr)對HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam修飾電極測定過氧化氫的干擾情況。采用電流～時間曲線法，于-0.3 V電位下測試(圖4)，由圖可見，10倍于過氧化氫濃度(500 μmol/L)的甘氨酸、抗壞血酸、脲、L-絡氨酸、葡萄糖、凝血酶對該修飾電極的催化性能影響較小，不影響過氧化氫的檢測，表明該修飾電極具有較強的抗干擾能力。

為了研究該修飾電極的實用性，分別于原始濃度為25.0、40.0、50.0 μmol/L的過氧化氫樣品中，加入47.0、63.0、78.0 μmol/L的過氧化氫進行回收率實驗，測得回收率為98.4%～102%。

2.6 HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam修飾電極的重現性及穩定性

以過氧化氫為例，采用同一根HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam對50 μmol/L的過氧化氫重復測定5次，發現電流響應的相對標準偏差(RSD)為3.5%。用5根平行制備的HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam修飾電極對50 μmol/L的過氧化氫進行檢測，其響應結果的RSD為3.2%。將該電化學傳感器存儲于4 ℃冰箱中，28 d后，在優化條件下對50 μmol/L的過氧化氫進行測定，發現修飾電極仍保留了87.5%的電流響應。表明該電化學傳感器具有良好的重現性和穩定性。

3 結 論

本文以電沉積法制備了HRP-AuNPs/CNTs/Ni foam修飾電極，使用SEM、EDS和電化學方法對電極進行了表征，并采用電化學循環伏安法和電流～時間曲線研究了修飾電極對過氧化氫、過氧化氫異丙苯、2-過氧化丁酮的電化學性能。結果顯示，修飾電極對上述3種過氧化物具有良好的催化檢測性能，且抗干擾能力強，可用于實際檢測。