2017年我國豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

胡星星，郭龍，宋文博，賈雙，袁意，喻紅艷，湯細彪

(武漢科前生物股份有限公司，武漢430070)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida, Pm)是一種革蘭陰性兼性厭氧球桿菌，正常定植于多種健康動物的口腔、鼻咽和上呼吸道[1]。當Pm大量繁殖導致內源性感染時可引起豬、禽、牛、羊、兔等經濟動物發生呼吸系統疾病、局灶性感染及出血性敗血癥[2-3]。此外，Pm還可通過貓狗咬傷、抓傷或舔舐感染人，威脅人類健康[1,4]。根據莢膜抗原的不同，Pm可分為A、B、D、E和F五個血清型。不同血清型可引起不同的疾病癥狀[5-8]，其中A型和D型產毒多殺性巴氏桿菌可以引起豬萎縮性鼻炎，造成世界養豬產業的重大經濟損失[7]。某些區域流行的血清型可隨時間變化，如1990年之前我國最流行A型和B型，其次為D型[9]。30年之后，A型和D型成為我國主要流行血清型，然后是B型[10]。目前豬巴氏桿菌病的控制主要依賴抗生素，然而，Pm易與其他病毒和細菌發生混合感染和繼發感染的特點[4]和臨床上濫用抗菌藥導致多重耐藥現象越來越嚴重的問題致使該病的防控極具挑戰。本實驗對2017年我國Pm的流行情況及其耐藥情況進行研究，以期為該病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DL2000 DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司；2×Easy Taq PCR SuperMix(+dye)購自北京全式金生物技術有限公司。胰蛋白大豆瓊脂(TSA)購自美國BD公司；輔酶I (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)購自上海化學試劑公司；新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程有限公司，20種藥敏試紙均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.2 樣品來源 樣品來自于全國24個省市的規模化豬場和散養戶送檢的有呼吸系統疾病癥狀病死豬的肺臟組織以及少量氣管、腦、肝臟、脾臟等其他組織樣品，共6288份。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養 無菌剪取肺臟等病變組織，劃線接種于含10 mg/L NAD和5%(V/V)新生牛血清的TSA平板上。將TSA平板置于37 ℃、50 mL/L CO2的恒溫培養箱培養18～24 h，觀察菌落形態并挑取優勢單菌落進行傳代培養。

1.2.2 細菌的PCR鑒定 根據Townsend等[11]建立的PCR方法，對分離菌株進行種屬鑒定和莢膜血清學分型。本實驗用于檢測Pm及其莢膜血清型的引物(表1)均由北京擎科創新生物科技有限公司合成。

Pm的PCR鑒定/血清型分型的反應體系如下(20 μL/25 μL)：2×Easy Taq PCR SuperMix(+ dye)10 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，模板1 μL，無核酸水補至20 μL/ 25 μL。反應條件如下：94 ℃預變性5 min；然后進入30個循環，94 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min。將PCR產物進行7.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統掃描照相。

表1 本實驗所用PCR引物Tab 1 PCR primers used in this experiment

1.2.3 藥敏試驗 對經PCR鑒定并分型的Pm分離株進行藥敏試驗。取培養好的菌液用無菌棉簽均勻涂布在TSA培養基上，用鑷子夾取藥敏紙片放置在平板上，每個平板上不超過6張藥敏紙片。將平板置于37 ℃恒溫培養箱中正置培養24～36 h后測量并記錄抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 Pm的分離鑒定及血清型分型 從6288份病死豬肺臟和其他病料組織中共分離出236株Pm，總分離率為3.75%。從236株Pm中隨機挑出55株進行PCR鑒定及血清型分型，其中A型菌株25株，D株菌株27株，F型菌株1株，未定型菌株2株，部分菌株的PCR鑒定如圖1所示。

2.2 Pm的地區流行情況 對各省市的地區分離率進行統計，結果如圖2所示，廣東省的地區分離率最高(4.97%，54/1087)，其次為湖南省(4.64%，15/323)，然后是河南省(3.69%，38/1030)、四川省(3.61%，9/249)、山東省(3.50%，9/257)和湖北省(3.25%，69/2125)，最后是福建省(1.87%，4/214)。其余各省份地區樣品數目少，且分離率較低，合計后其總分離率為3.79%(38/1003)。

M.DL2000 DNA marker；1.Pm的鑒定產物；2.A型菌株PCR產物；3.D型菌株PCR產物；4.F型菌株PCR產物；5.陰性對照M: DL2000 DNA marker; 1. PCR product of Pm for identifying; 2. PCR product for capsular type A; 3. PCR product for capsular type D; 4. PCR product for capsular type F; 5. Negtive control圖1 多殺性巴氏桿菌的PCR鑒定及莢膜分型Fig 1 Identification and capsular typing of Pm by PCR

圖2 2017年我國豬源多殺性巴氏桿菌地區分布圖Fig 2 Map of the regional distribution of Pasteurella multocida in 2017 in China

2.3 Pm的單純感染和混合感染情況 在分離出Pm的236份病料中，僅分離出Pm的病料有101份，所占比例為42.80%，其余135份病料能同時分離出Pm和其他各種不同的共感染菌，占比57.2%。如圖3所示，兩種菌混合感染時最常見的共感染菌為鏈球菌(28.81%，68/236)，其次是副豬嗜血桿菌(12.29%，29/236)，然后是大腸桿菌(2.12%，5/236)、葡萄球菌(1.69%，4/236)和支氣管敗血波氏桿菌(1.27%，3/236)，豬丹毒絲菌和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌也偶爾共感染。三種菌混合感染時最常見的共感染菌為鏈球菌和葡萄球菌(4.24%，10/236)，其次是鏈球菌和副豬嗜血桿菌(3.81%，9/236)，最后是鏈球菌和大腸桿菌(1.69%，4/236)。

Pm.多殺性巴氏桿菌；SS.豬鏈球菌；HPS.副豬嗜血桿菌；E.coli.大腸桿菌；Bb.支氣管敗血波氏桿菌；S.hyicus.葡萄球菌；APP.傳染性胸膜放線桿菌；SE.豬丹毒桿菌Pm. Pasteurella multocida; SS. Streptococcus suis; HPS. Haemophilus parasuis; E.coli. Escherichia coli; Bb. Bordetella bronchiseptica; S.hyicus. Staphylococcus; APP. Actinobacillus pleuropneumoniae; SE. Swine erysipelas圖3 2017年我國豬源多殺性巴氏桿菌感染情況Fig 3 Infection of Pasteurella multocida in 2017 in China

2.4 Pm的耐藥情況 經鑒定并分型的55株Pm對20種臨床常用抗菌藥物的敏感性檢測結果見表2，由表可知Pm對強力霉素的耐藥率最高(83.64%)，對卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素和阿米卡星等氨基糖苷類藥物的耐藥率次之(43.64%～52.73%)，對氨芐青霉素、壯觀霉素、甲氧胺嘧啶和環丙沙星也有較高的耐藥率(21.82%～29.09%)。Pm對氧氟沙星和多粘菌素B的耐藥率最低(均為1.82%)，另外Pm對頭孢類抗生素、阿莫西林、阿奇霉素等耐藥性也較低。

表2 55株豬源多殺性巴氏桿菌分離株對20種藥物的敏感性Tab 2 The sensitivities of 55 strains of porcine Pasteurella multocida isolates to 20 drugs

3 討論與結論

Pm是豬呼吸系統疾病綜合征(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)的重要致病原之一。Tang X等從2003-2007年采集的2912份呼吸道疾病病料中分離出233株Pm，總分離率為8.0%[10]；LIU H等報道2011至2015年我國12個省病料中Pm的分離率為9.2%(295/3212)[12]；本文的研究結果顯示2017年來自我國24個省市的6288份病料中Pm的總分離率為3.7%，相比其他學者的報道總分離率明顯下降，一方面可能是由于樣品來源地區和病料份數增多，另一方面也說明隨著我國養殖水平的提高，大部分豬場對豬巴氏桿菌病等細菌病的防控更加規范、有效。本實驗隨機挑選的55株Pm中A型和D型菌株的占比分別為45.5%(25/55)和49.1%(27/55)，相較于2003年至2007年的占比(39.5%和54.9%)[10]和2011年至2015年的占比(49.3%和47.6%)[12]有所變化，可能與樣品來源地區增加和不同地區流行的主要血清型不同有關。例如湖南省主要流行A型菌株(64.5%)，其占比明顯高于D型菌株(30.6%)[13]；而河南省A型菌株和D型菌株占比分別為43.86%和56.14%[14]。

Pm屬于條件致病菌，在豬抵抗力低下時可侵入機體而發生內源性感染。Gao等認為炎熱和潮濕的氣候會增加豬巴氏桿菌病發生的風險[15]，這可能是廣東省的Pm地區分離率(4.97%)明顯高于總分離率(3.75%)的原因之一。河南省和湖北省的地區分離率(分別為3.69%和3.25%)接近總分離率，且Pm分離株占比較大(分別為16.10%和29.24%)。盡管湖南省和山東省的Pm地區分離率分別高達4.64%和3.50%，但是其Pm分離株所占比例均較少(6.36%和3.81%)，且檢測病料份數相對較少(323份和257份)。

Pm常與多種病原發生混合感染，從而增加豬群呼吸道疾病的發病率和死亡率，造成極大經濟損失。本研究僅分離出Pm株數所占比例(42.80%)不到總Pm分離株的一半，表明Pm與其他細菌發生混合感染的情況非常普遍，其中與鏈球菌和副豬嗜血桿菌最為多見，Tang X和Zhao Z等也曾報道過相似的結果[10,16]。因此，在治療豬巴氏桿菌病時需多管齊下，針對這些共感染菌的多價疫苗而非針對Pm的單價疫苗的研制是控制該病的方向之一[12]。藥敏試驗的結果顯示，Pm對氧氟沙星、多粘菌素B、頭孢類和阿莫西林的耐藥率均較低，臨床上常用頭孢類抗生素和阿莫西林來控制Pm。Pm對強力霉素的耐藥率高達83.64%，這與臨床上該類藥物的廣泛使用和本身特點有關，混合感染的細菌間交換四環素耐藥基因會產生很強的選擇壓力[17]。Pm對青霉素類、磺胺類、氨基糖苷類藥物的耐藥率相對較高，與2016年上海市分離的20株Pm的耐藥性相似[18]。定期監測細菌耐藥性可有效避免藥物濫用，并指導臨床科學用藥。