板芪口服液急性毒性及長期毒性試驗研究

楊慧，孫耀貴，孫娜，尹偉，范闊海，李宏全

(山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801)

病毒性心肌炎是由多種病毒感染引起的，以心肌細胞變性、壞死、間質炎性細胞浸潤和纖維滲出為主要改變的心肌疾病。臨床上豬瘟、豬腦心肌炎病毒、豬丹毒、豬肺疫、炭疽、口蹄疫等多種病毒與細菌感染仔豬造成了大量死亡，給養殖業帶來了巨大的經濟損失。現代醫學使用抗病毒抑制劑、免疫抑制劑、免疫調節劑來治療病毒性心肌炎，僅能控制病毒復制、改善血液動力學，并不能全方位的治療疾病[1]。中藥復方不僅具有價格低廉、不易產生耐藥性的特點，還可以從根本和整體上調理機體。

實驗室根據臨床經驗研發的板芪口服液是將板藍根、丹參、黃芪、黃芩等藥材合理配伍而成。單味藥材具有涼血消癰、益氣養陰、清熱解毒、調節免疫等功效，針對病毒性心肌炎也具有良好的治療效果。其中板藍根具有良好的抗炎、鎮痛及抗病毒的作用[2]；丹參具有涼血消癰之功效，可用于胸痹心痛，其主要成分丹參酮ⅡA具有很好抗病毒作用，并可修復心肌損傷[3]；黃芪具有抗病毒及調節免疫的作用[4]，可以改善急性病毒性心肌炎心肌結構的損傷、抗心律失常和保護心肌[5-6]；黃芩具有抗病毒、抗炎和調節免疫損傷的功效[7]。研究將諸藥合理配伍以期對治療病毒性心肌炎能達到更好的效果。

研究旨在探討板芪口服液對小鼠急性毒性試驗的安全性，對大鼠長期毒性試驗中大鼠周增重、血液生化及組織病理學的影響，以及長期毒性試驗2周恢復期是否具有毒性可逆反應和遲發性反應，為臨床提供毒理方面的參考依據。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 板芪口服液由山西奧信動物藥業有限責任公司試生產。規格為1 g生藥·mL-1，生產批號：20171123。板芪口服液由黃芪、板藍根、丹參、黃芩等藥材分二次煎煮，合并煎煮液濾過，濃縮至工藝要求密度后濾過灌封。

1.2 實驗動物及飼養條件 SD大鼠，80只，SPF 級，雌雄各半，體重60～90 g，昆明系小鼠60只，SPF 級，雌雄各半，體重18～20 g ，由北京市海淀興旺動物養殖場提供，生產許可證號：SCXK(京)2014-0013。每日自由飲水進食，飼養條件良好，符合動物倫理委員會的管理準則。

1.3 實驗儀器 全自動血液分析儀(海力孚 HF-3800)；AU-400全自動生化分析儀(海力孚 HF-8004)；石蠟包埋機(KD-BM型，浙江金華益迪醫療設備廠)；全自動輪轉切片機(RM2265型，德國徠卡)；攤片機(德國徠卡)。

1.4 主要試劑 蘇木素染色液、伊紅染色液、中性樹膠、苦味酸均購自 Solarbio 公司。谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TCH) 試劑盒購自長春匯力生物技術有限公。肌酐(CREA)、甘油三酯(TG) 購于南京建成生物工程研究所。

1.5 板芪口服液對小鼠急性毒性試驗 預試驗將板芪口服液煎至最大藥物濃度。30只小鼠，雌雄各半，隨機分3組，以最大給藥容積24 h內分3次給藥，飼養觀察一周，小鼠健康活潑，無一死亡。

因無法獲得半數致死量，正式試驗取健康小鼠30只，雌雄各半，稱重，以最大給藥劑量270 g生藥·kg-1灌胃。連續觀察7 d，并稱重記錄；如有死亡立即剖檢觀察；14 d后處死，尸檢肉眼觀察內臟器官有無異常改變。

1.6 板芪口服液對大鼠長期毒性試驗 將80只大鼠隨機分為板芪口服液低、中、高劑量組和空白對照組，每組20只，雌雄各半。板芪口服液三個劑量分別為10 、20、40 g生藥/kg體重，分別相當于豬臨床推薦量的20、40、80倍，對照組灌服等體積蒸餾水，給藥容積為1 mL·100 g-1體重，連續給藥30天。每周稱重一次，按新的體重調整給藥量。停藥后24 h每組取14只大鼠，雌雄各半，進行血液學、血液生化指標檢測，并進行系統尸檢及主要臟器病理組織學檢查。各組剩余大鼠停藥后繼續觀察2周，同法進行上述指標的測定和檢查。在整個試驗階段每天觀察大鼠精神狀態、行為、活動、毛色、二便等一般體征。

1.7 長期毒性試驗主要臟器解剖及組織學觀察 分別于末次給藥后24 h和停藥后第15 d，對試驗大鼠進行系統解剖，肉眼觀察看有無異常變化。并制作心、肝、脾、肺、腎、睪丸、卵巢、甲狀腺、淋巴結、腎上腺、胸腺、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸的組織切片，進行病理組織學檢查，看有無異常變化。

1.8 統計方法 統計方法采用SPSS統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差(Mean±SD)表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 板芪口服液對小鼠急性毒性試驗 小鼠給藥后，連續觀察7 d，全部存活，行為及活動正常，未見不良反應。體重增長(表1)。

表1 板芪口服液對小鼠體重的影響 Tab 1 Effect of Banqi(Oral liquid)on the body weight of mice

給藥觀察14 d內，無動物死亡。剖檢，肉眼觀察無病理變化。小鼠最大給藥劑量為270 g生藥·kg-1，相當于豬臨床推薦劑量(0.5 g生藥·kg-1)的540倍，說明板芪口服液安全評價為無毒。

2.2 板芪口服液對大鼠長期毒性試驗 由表2、3可知，各給藥組雌性和雄性大鼠平均周增重與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。末次給藥后24 h及停藥后15 d，各給藥組大鼠的血液學指標和血液生化指標與空白對照組相比無顯著性差異，結果見表4、表5。

表2 板芪口服液對雌性大鼠平均周增重的影響Tab 2 Effect of Banqi oral liquid on the average weight gain of female rats

同行數據進行方差分析，右上角字母相同表示差異性不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

表3 板芪口服液對雄性大鼠平均周增重的影響Tab 3 Effect of Banqi oral liquid on the average weight gain of male rats

表4 板芪口服液對大鼠血液學指標的影響Tab 4 Effects of Banqi oral liquid on hematological indexes in rats

表5 板芪口服液對大鼠血液生化指標的影響Tab 5 Effect of Banqi oral liquid on blood biochemical indexes in rats

2.3 臟器病理解剖及組織學檢查 末次給藥后24 h及停藥后15 d，對板芪口服液高劑量組大鼠進行系統尸檢及HE染色，并與空白對照組進行比較。由圖1可見(1)心肌纖維平行排列，胞漿染色均勻，胞核清晰呈橢圓形。(2)肝小葉結構清晰，以中央靜脈為中心，肝細胞索和肝血竇向周圍呈放射狀排列，胞漿豐富。(3)脾臟中白髓動脈周圍淋巴鞘和脾小體邊界清楚，紅髓中脾血竇和脾索結構清晰。(4)肺泡組織形態、結構清晰，肺泡無塌陷及破裂，肺泡充盈適度，肺泡囊管壁結構完整。(5)腎臟中腎小體結構完整，腎小球位于小體中央且結構完整。

由圖2可見，(1)睪丸曲精細管排列整齊，管腔中無脫落的細胞，支持細胞正常。(2)卵巢內可見卵巢上皮細胞和卵泡細胞，細胞形態規則。(3)甲狀腺濾泡結構清晰，以扁平細胞為主，濾泡間結締組織少，血管豐富。(4)淋巴結皮質內淋巴小結輪廓清晰，生發中心明顯，副皮質較寬。(5)腎上腺皮質與髓質分界明顯。皮質部球狀帶、束狀帶、網狀帶的細胞結構正常。(6)胸腺皮髓界限清楚，小葉明顯，皮質部成熟的淋巴細胞較多，髓質部可見明顯的胸腺小體。由圖3可見，十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸腸絨毛上皮完整，固有層無損傷，黏膜下層、肌層未見病變。

圖1 大鼠主要臟器組織切片(HE×400)Fig 1 The main organs of rats histopathology (HE×400)

圖2 大鼠臟器組織病理學(HE×400)Fig 2 The organs of rats histopathology (HE×400)

圖3 大鼠腸道組織切片(HE×100)Fig 3 Intestinal histopathology in rats (HE×100)

3 討論與結論

試驗根據獸藥研究技術指導原則[8]探究板芪口服液的安全性。初步預試驗中將板芪口服液濃縮至最大濃度6 g/mL，此時藥物無沉淀且恰好能通過12號灌胃針。小鼠24 h內經口多次給藥達最大容積，一般0.8～1 mL，觀察小鼠一周，除第1天小鼠灌胃后出現短暫不適，活動減少以外，未見動物中毒與死亡。因受小鼠給藥容積與藥物濃度的限制，無法測定LD50，因此，以最大給藥量(MTD)進行試驗[9]。本試驗小鼠最大給藥劑量為270 g生藥·kg-1體重，相當于豬臨床推薦劑量(0.5 g生藥·kg-1體重)的540倍，急性毒性試驗中安全評價為無毒。

長期毒性試驗是通過臨床表現、血液學、血清生化、病理組織切片來考察灌胃藥物對大鼠持續給藥的毒性。血液學指標反映機體內環境及造血功能的變化，血清生化指標檢驗機體生理成分、代謝情況及重要器官的功能狀態，其中腎功能及肝功能的變化是考察藥物是否存在蓄積毒性。本試驗結果顯示板芪口服液各劑量組血液學與血清生化結果均在正常參考值范圍內，與空白組相比無顯著差異。長期毒性試驗2周恢復期結果表明板芪口服液沒有出現毒性可逆反應和遲發性反應。板芪口服液治療的靶器官為心臟，從病理切片來看高劑量組并未對大鼠心臟造成傷害，對其它主要臟器、免疫器官、生殖器官及腸道也未造成損害，由此說明板芪口服液安全無毒，可用于臨床試驗。

另一方面，由于中醫辨證施治的靈活性導致臨床用藥的千差萬別，使得防治病毒性心肌炎病的單味有效藥物篩選較為困難，且單味中藥組成成分復雜，有效成分的確定和分離提取困難，嚴重影響藥物的開發與應用。多數單味中藥的實驗研究是通過調節白細胞介素水平[10]、氧化應激損傷及影響NF-kB信號通路[11]，起到治療病毒性心肌炎的作用。而中藥復方制劑則是從降低心肌酶水平，改善心肌細胞的病理損傷，調節免疫等方面進行。馬麗等[12]發現益心康能夠降低心肌酶水平，減輕細胞病變，保護心肌。何偉等[13]認為益氣活血中藥復方可從細胞免疫、體液免疫及紅細胞免疫等方面起到雙向調節作用。中醫藥整體調節治療的優勢，是西醫單一化學合成藥及中藥單體成分難以達到的。同時，中藥復方因制備較為簡單，價格低廉，藥物毒性低，安全性高，在臨床上受到廣泛關注。實驗室研發的板芪口服液根據臨床經驗組方改進，將具有涼血消癰、益氣養陰、清熱解毒、調節免疫，尤其對治療病毒性心肌炎有良好作用的單味藥材科學配伍，經過毒理試驗證明其安全性，為之后的藥理及臨床試驗奠定基礎。