茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠免疫功能的影響

龐艷華，郝福星，韓玲玲，韋芊含，趙澤婷，陳昕,張雨梅,3*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

茶樹(shù)為桃金娘科白千層屬植物，茶樹(shù)油是從其新鮮枝葉中提取的，經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的天然芳香精油[1-2]。茶樹(shù)油主要由單萜組成，具有抗細(xì)菌[3]，抗真菌[4]，抗病毒[5]和消炎等作用。在澳大利亞，茶樹(shù)油作為民間藥物常用來(lái)治療感染、炎癥、腹瀉和外傷[6]。在二戰(zhàn)期間，茶樹(shù)油也發(fā)揮了巨大作用，在治療傷員的皮膚損傷上效果顯著[7]。目前茶樹(shù)油是已發(fā)現(xiàn)的天然物質(zhì)中抗菌作用最強(qiáng)的，也是極具價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ募兲烊恢参锞椭籟8-9]。

目前，我國(guó)對(duì)茶樹(shù)油無(wú)論是提取還是深加工都得到了很好的成果，，茶樹(shù)油及其相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有良好的前景。本研究擬通過(guò)灌胃給予小鼠茶樹(shù)油，首先進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，確定LD50值，然后通過(guò)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性試驗(yàn)、脾淋巴細(xì)胞增殖能力試驗(yàn)、免疫器官指數(shù)試驗(yàn)、測(cè)定血清溶血素水平及外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群水平，考察茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠免疫功能的影響，為探索茶樹(shù)油及其主要成分的作用，獲得可靠數(shù)據(jù)，以研制出新的茶樹(shù)油深加工產(chǎn)品，為茶樹(shù)油產(chǎn)品在日化、食品、香料、醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)[10-11]。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠(清潔級(jí))，體重18～22 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(蘇)2017-0004，使用許可證號(hào)為SYXK(蘇)2017-0044。飼喂經(jīng)60Co照射飼料，環(huán)境溫度為(24±2)℃，濕度為(60±20)%，飲水為符合城市飲用水標(biāo)準(zhǔn)的自來(lái)水。試驗(yàn)開(kāi)始前于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)3 d，灌胃前禁食12 h，不限制其飲水。

1.2 試驗(yàn)藥品 茶樹(shù)油提取物粉(澳葉寶)，由20%澳洲茶樹(shù)油提取物與微晶纖維素制成的白色粉末，由江蘇無(wú)錫晨芳生物科技有限公司提供，批號(hào)為20160320。

表1 茶樹(shù)油提取物主要成分Tab 1 The main composition of the tea tree oil extract powder/%

1.3 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；100×青霉素鏈霉素溶液，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；MTT、小鼠淋巴細(xì)胞分離液、臺(tái)盼藍(lán)均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，MTT用pH7.2～7.4 PBS配成5 mg/mL的溶液，微孔濾器過(guò)濾除菌，4℃避光保存，不能超過(guò)1個(gè)月，現(xiàn)配現(xiàn)用；刀豆蛋白A Ⅳ(ConA，Ⅳ)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，20 μg/mL ConA 用RPMI1640完全培養(yǎng)液稀釋，微孔濾器過(guò)濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用；DMSO，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方 法

2.1 急性毒性試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，茶樹(shù)油提取物粉劑量達(dá)5000 mg/kg b.w.時(shí)，小鼠未出現(xiàn)死亡。因茶樹(shù)油提取物粉的毒性較小，無(wú)法測(cè)出LD50數(shù)值，根據(jù)急性毒性試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范，對(duì)茶樹(shù)油提取物粉進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。

取ICR小鼠20只，雌、雄各半，以0.2 mL/10g b.w.給藥容積灌胃，劑量為5000 mg/kg b.w.。連續(xù)觀察2周，并記錄動(dòng)物中毒癥狀及死亡情況。

2.2 對(duì)小鼠免疫功能的影響

2.2.1 試驗(yàn)分組 將ICR小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，雌雄各半。茶樹(shù)油提取物粉以1%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液，灌胃給予。茶樹(shù)油提取物粉試驗(yàn)組分為高劑量(1250 mg/kg b.w.)、中劑量(250 mg/kg b.w.)、低劑量組(50 mg/kg b.w.)以及1%羧甲基纖維素鈉對(duì)照組。以0.2 mL/10g b.w給藥容積灌胃，每天給藥一次，連續(xù)灌胃10 d后，分別進(jìn)行以下試驗(yàn)。

2.2.2 免疫器官指數(shù)試驗(yàn) ICR小鼠分組及處理同2.2.1。小鼠連續(xù)灌胃10天后，于第11天，脫頸椎處死小鼠，稱量小鼠體重及肝臟、脾臟、胸腺的重量，并按以下公式計(jì)算免疫器官指數(shù)(肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù))[12]。

免疫器官指數(shù)=免疫器官鮮重(g)/體重(g)×100%

2.2.3 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性試驗(yàn) 小鼠灌胃10 d后，于第11天，按照文獻(xiàn)[13]的方法，測(cè)定腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性。

2.2.4 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 小鼠灌胃10 d后，于第11天，無(wú)菌取脾、研磨后過(guò)200目不銹鋼網(wǎng)，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法，測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖能力。

2.2.5 外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群水平測(cè)定試驗(yàn) 小鼠連續(xù)灌胃10 d，于末次灌胃12 h后，摘眼球采血0.5 mL，以4% EDTA-Na2抗凝。根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法，測(cè)定小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平。

2.2.6 血清溶血素水平測(cè)定試驗(yàn) 小鼠分組及處理同2.2.1。于灌胃第3天 ，每只小鼠腹腔注射0.2 mL的5%雞紅細(xì)胞進(jìn)行免疫，小鼠免疫后再連續(xù)灌胃7 d，摘眼球取血，根據(jù)文獻(xiàn)[16]的試驗(yàn)方法，測(cè)定血清溶血素。

2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS17.0軟件，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素分析Duncan's法進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05作為差異顯著性水平。

3 結(jié)果與分析

3.1 茶樹(shù)油提取物粉的小鼠急性毒性試驗(yàn) 茶樹(shù)油提取物粉按5000 mg/kg b.w.劑量灌胃給予小鼠后，二周內(nèi)未見(jiàn)明顯的眼觀異常。

茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠經(jīng)口LD50大于5000 mg/kg b.w.，根據(jù)WHO對(duì)化學(xué)物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，茶樹(shù)油提取物粉屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)別。

3.2 茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠免疫器官的影響 不同劑量茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響見(jiàn)表3-1。與對(duì)照組相比，茶樹(shù)油高、中、低劑量組均能極顯著增加小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01)； 250 mg/kg b.w.劑量組能顯著提高小鼠肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)(P<0.05)；50、1250 mg/kg b.w.劑量組的肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的差異不顯著(P>0.05)。

表3-1 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響Tab 3-1 Effect on immune organ index in mice/%

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

Compared with the normal control group, *P<0.05, **P<0.01

3.3 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性試驗(yàn) 不同劑量的茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響見(jiàn)表3-2。由表3-2可以看出，與對(duì)照組相比，茶樹(shù)油提取物粉三個(gè)試驗(yàn)劑量，都可增加小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬活性，但50 mg/kg b.w.劑量差異不顯著(P>0.05)；250 mg/kg b.w.劑量組差異極顯著(P<0.01)；1250 mg/kg b.w. 劑量組差異顯著(P<0.05)。

表3-2 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性、血清溶血素及脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Tab 3-2 Effects of phagocytic activity, serum hemolysin and spleen lymphocyte proliferation in mouse macrophages

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

Compared with the normal control group,*P<0.05,**P<0.01.

3.4 茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

不同劑量組茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響結(jié)果見(jiàn)表3-2。由表可以看出，與對(duì)照組相比，茶樹(shù)油提取物粉三個(gè)試驗(yàn)劑量處理后，小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。50 mg/kg b.w.劑量組刺激指數(shù)顯著提高；250 mg/kg b.w.劑量組和1250 mg/kg b.w.劑量組刺激指數(shù)極顯著的升高，極顯著的增強(qiáng)了小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力。

3.5 茶樹(shù)油提取物粉對(duì)外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群水平的影響 茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群水平的影響結(jié)果見(jiàn)表3-3。與對(duì)照組相比，50 mg/kg b.w.劑量組CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)；250 mg/kg b.w.劑量組CD4+/CD8+比值顯著增加(P<0.05)；高、中低劑量茶樹(shù)油提取物對(duì)小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+CD8+指標(biāo)無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3-3 對(duì)小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞亞群的影響Tab 3-3 Effects of CD3+, CD4+ and CD8+ T lymphocyte subsets in peripheral blood of mice

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

Compared with the normal control group,*P<0.05

3.6 茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響

茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠血清溶血素的影響結(jié)果見(jiàn)表3-2。由表可以看出，與對(duì)照組相比，250 mg/kg b.w.和1250 mg/kg b.w. 劑量組中小鼠血清溶血素水平均顯著性增加(P<0.05)。但50 mg/kg b.w.劑量組中小鼠血清溶血素水平增加不顯著(P>0.05)。

4 討論與結(jié)論

4.1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) 急性毒性實(shí)驗(yàn)一般采用嚙齒類或非嚙齒類兩種動(dòng)物。通常為小鼠或大鼠采用經(jīng)口、吸入或經(jīng)皮感染途徑。對(duì)小鼠進(jìn)行一次或24 h內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后，觀察動(dòng)物急性中毒表現(xiàn)，來(lái)了解新藥急性毒性的強(qiáng)弱，為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)和特殊毒性試驗(yàn)劑量設(shè)置提供依據(jù)，同時(shí)為新藥藥學(xué)研究提供參考[17]。本試驗(yàn)中茶樹(shù)油提取物粉經(jīng)口LD50大于5000 mg/kg b.w.，屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)別。

4.2 小鼠免疫器官與免疫功能 免疫器官是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，胸腺是T淋巴細(xì)胞分化成熟的部位，脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官，介導(dǎo)著全身的體液免疫和細(xì)胞免疫[18]。而肝臟又是體內(nèi)最大的解毒器官，機(jī)體主要靠肝臟來(lái)代謝，承擔(dān)著維持生命的重要功能。免疫器官指數(shù)是衡量機(jī)體免疫器官發(fā)育情況的經(jīng)典指標(biāo)。本次試驗(yàn)中，不同劑量的茶樹(shù)油提取物粉能顯著提高小鼠的脾臟指數(shù)，對(duì)小鼠的脾臟發(fā)育有著極明顯的促進(jìn)作用，而250 mg/kg b.w.劑量組的肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)有顯著提高，效果最好。這說(shuō)明茶樹(shù)油提取物粉能促進(jìn)脾臟、肝臟和胸腺等免疫器官的增重，增強(qiáng)了機(jī)體的免疫功能。

4.3 腹腔巨噬細(xì)胞是評(píng)價(jià)免疫功能的重要指標(biāo) 巨噬細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體內(nèi)，在免疫反應(yīng)中具有重要作用，它不僅參與非特異性吞噬功能，還是特異性免疫中一類關(guān)鍵的細(xì)胞[19-20]。巨噬細(xì)胞能參與攝取、加工、處理、提呈抗原并激發(fā)免疫反應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的收集、分離和培養(yǎng)，探討茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠免疫功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶樹(shù)油提取物粉三個(gè)試驗(yàn)劑量，都可增加小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬活性，這說(shuō)明茶樹(shù)油提取物粉能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性，促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬作用。

4.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖是評(píng)價(jià)免疫功能的重要指標(biāo) 小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能可以作為特異性細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)，是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)之一，淋巴細(xì)胞的增殖狀況反映了機(jī)體細(xì)胞免疫的狀況。脾細(xì)胞的增殖能力可以通過(guò)研究脾臟T淋巴細(xì)胞在促分裂劑ConA作用下的增殖能力來(lái)反應(yīng)細(xì)胞免疫功能[24]。刺激指數(shù)SI值與活脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。SI值越大，淋巴細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。試驗(yàn)不同劑量組茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，茶樹(shù)油提取物粉三個(gè)劑量組的SI值顯著高于正常對(duì)照組，這說(shuō)明不同劑量組的茶樹(shù)油提取物粉能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化，且250 mg/kg b.w.和1250 mg/kg b.w.劑量組效果顯著。證實(shí)茶樹(shù)油提取物粉在一定劑量下能提高特異性細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)細(xì)胞免疫。

4.5 外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群是評(píng)價(jià)免疫功能的重要指標(biāo) 淋巴細(xì)胞亞群主管細(xì)胞免疫，具有抵抗病毒和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用[25]，細(xì)胞功能取決于T淋巴細(xì)胞總值(CD3+)及其亞群(CD4+、CD8+)的相對(duì)組成。流式細(xì)胞分析儀FCM根據(jù)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的不同來(lái)檢測(cè)各淋巴細(xì)胞亞群。用CD4+/CD8+比值來(lái)判斷機(jī)體內(nèi)部是否紊亂，CD4+/CD8+比值上升，則表明細(xì)胞免疫功能活躍，反之則細(xì)胞免疫功能處于遲滯狀態(tài)[26]。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)油提取物粉250 mg/kg b.w.劑量組CD4+/CD8+比值顯著增加(P<0.05)，表明細(xì)胞免疫功能處于活躍狀態(tài)，其他劑量組與對(duì)照組相比差異不顯著。這說(shuō)明250mg/kg b.w.劑量的茶樹(shù)油提取物粉對(duì)細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用，能提高機(jī)體的免疫功能。

4.6 血清溶血素是評(píng)價(jià)免疫功能的重要指標(biāo) 小鼠血清溶血素的水平是一項(xiàng)機(jī)體非特異性免疫功能的主要指標(biāo)[20-21]，溶血值的測(cè)定反映了B細(xì)胞的增殖分化以及與補(bǔ)體結(jié)合后向體液中分泌溶血素的能力，其介導(dǎo)的是體液免疫[22]。通過(guò)測(cè)定溶血素值，用以檢測(cè)藥物對(duì)機(jī)體防御能力的影響[23]。本實(shí)驗(yàn)中，茶樹(shù)油提取物粉三個(gè)試驗(yàn)劑量組中，小鼠血清溶血素水平都有所增加，這說(shuō)明茶樹(shù)油提取物粉具有刺激B細(xì)胞分化增殖轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細(xì)胞的功能，促進(jìn)小鼠溶血素抗體的生成，提高抗體水平，增強(qiáng)小鼠體液免疫功能。

4.7 結(jié)論 茶樹(shù)油提取物粉經(jīng)口LD50大于5000 mg/kg b.w.，根據(jù)WHO對(duì)化學(xué)物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，茶樹(shù)油提取物粉屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)別。

不同劑量的茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)都有著極明顯的促進(jìn)作用，對(duì)肝指數(shù)和胸腺指數(shù)也有一定的促進(jìn)作用。

茶樹(shù)油提取物粉通過(guò)促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬活性、淋巴細(xì)胞的增殖、提高血清溶血素的水平以及CD4+/CD8+比值，表明茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠免疫功能具有促進(jìn)作用。

茶樹(shù)油提取物粉通過(guò)增加免疫器官指數(shù)、增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性、脾淋巴細(xì)胞的增殖能力、提高血清溶血素的水平以及CD4+/CD8+比值，表明茶樹(shù)油提取物粉對(duì)小鼠免疫功能具有一定的促進(jìn)作用。