牛結核桿菌MPB70-ESAT-6融合蛋白的原核表達及抗原反應性分析

姜秀云，董陽，包艷紅，張建寧，方詩文，金海玲，王寧，馬紅霞*

( 1.吉林農業大學生命科學學院，長春130118；2.吉林農業大學動物科技學院，長春130118；3.長春科技學院生物食品學院，長春130600)

牛結核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛結核桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的牛、鹿等多種動物及人共患的慢性細菌性疫病，是世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties, OIE)規定的B類疫病之一。人通過與患病動物的密切接觸[1]及飲用未消毒的乳制品[2]而患病。另外，人結核分枝桿菌也可傳播給牛和其他動物[3-4]，從牛乳[5]和不同動物組織[6-7]中可廣泛地分離出結核分枝桿菌。可見，致病性結核桿菌可在人和動物之間的相互傳播，給結核病的控制帶來了相當的困難。目前，檢測牛結核病唯一的方法是OIE指定的牛結核菌素(Purified Protein Derivative，PPD)變態反應[8]，但是該方法存在較高的非特異性反應，由此造成不必要的經濟損失令許多發展中國家難以承擔。而現有的臨床上唯一應用的疫苗——卡介苗(Bacillus of Calmette and Guerin，BCG)又不能用于牛的接種。因此，畜牧業生產中亟需適于牛結核病診斷和預防的新型抗原和疫苗。

MPB70和ESAT-6是結核分枝桿菌分泌到細胞外的主要蛋白質，MPB70是菌體表面蛋白，但BCG中表達水平低下或不表達[9]，ESAT-6是菌體的毒力因子，由RD1區基因編碼，只存在于致病結核分枝桿菌中，但不存在于環境分枝桿菌和BCG中，已被提議作為區分感染和接種動物試驗候選抗原[10]。另外，MPB70中存在多個Th1型細胞抗原表位[11]，能誘導免疫動物產生IFN-γ[12]，ESAT-6能夠引起顯著的體液免疫和細胞免疫[13]及有效的保護作用[14]。可見，MPB70和ESAT-6均是結核病新型診斷抗原和疫苗的靶點。目前，人們越來越關注血清學方法與傳統的細胞介導免疫技術相結合，以提高結核感染的檢出率，尤其是利用融合蛋白或多重抗原來提高血清學診斷的敏感性[15-18]。因此，將MPB70和ESAT-6兩個特異性抗原基因通過重疊延伸 ( Splicing by Overlapping Extension，SOE) PCR技術相融合，并進行原核表達及抗原反應性分析，為融合蛋白MPB70-ESAT-6用于牛結核病的診斷及疫苗研制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 基因、載體及菌株 pGEM-T-70和pGEM-T-esat-6由吉林省新獸藥研發與創制重點實驗室構建；pET28a(+)為Novagen公司產品；T-Vector pMD19購于寶日醫生物技術(北京)有限公司；EscherichiacoliDH5ɑ、E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)為吉林省新獸藥研發與創制重點實驗室留存。

1.2 酶與主要試劑BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA Ligase、LATaqDNA聚合酶、Pyrobest DNA Polymerase、DNA Markers及DNA凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產品；卡那霉素(Kanamycin，Kan)、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)均Amresco公司產品；異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)為Invitroge公司產品；Ni-NTA Agarose為QIAGEN公司產品；牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)為Roche公司產品；牛結核陽性血清采自結核病變牛；HRP標記羊抗牛IgG為北京百奧萊博科技有限公司產品。

1.3 引物的設計與合成 依據mpb70、esat-6的堿基序列，利用生物軟件設計PCR引物，序列見表1，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。引物P1-70、P2-esat-6中分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。

表1 引物序列Tab 1 Sequence of Primer

1.4 融合基因的擴增 首先利用pGEM-T-70、pGEM-T-esat-6為模板，以P1-70和P2-70、P1-esat-6和P2-esat-6為引物，應用Pyrobest DNA Polymerase分別對mpb70與esat-6基因進行PCR 擴增。再以mpb70和esat-6的擴增產物為模板，以P1-70-和P2-esat-6為引物，通過LATaqDNA對mpb70-esat-6進行擴增。擴增產物利用凝膠回收純化試劑盒純化。

1.5 mpb70-esat-6的克隆和序列分析 將mpb70-esat-6和T-Vector pMD19用Solution I連接，構建重組質粒pMD-70-esat-6，轉化至感受態E.coliJM109中，振蕩培養1 h，于固體LB培養基(100 mg/L Amp)中培養。轉化菌于液體LB培養基中培養過夜。提取質粒，進行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，重組質粒由吉林省庫美生物科技有限公司予以測序。

1.6 重組表達載體的構建與鑒定 以BamHⅠ、EcoRⅠ酶切pMD-70-esat-6和pET28a(+)，回收產物通過T4 DNA Ligase連接，構建pET-70-esat-6。轉化至E.coliBL21(DE3)中，于LB(50mg/L Kan)固體培養基中培養過夜。轉化菌經液體LB培養后，提取質粒并酶切分析。

1.7 mpb70-esat-6的誘導表達及鑒定 將重組菌接種于含Kan的液體LB培養基中，37 ℃ 振蕩培養至OD600nm≥0.65，用1 mmol/L IPTG誘導，而后每小時留存少量菌液，共誘導7 h。將留存的菌液OD600nm調至0.65，吸菌液1.0 mL，離心后，于菌體中加雙蒸水80 μL。加上樣緩沖液，煮沸處理后，進行SDS-PAGE。

1.8 MPB70-ESAT-6表達形式分析 將表達菌株接種于200 mL液體LB中培養，經IPTG誘導4 h后，離心收集菌體。超聲破碎后，離心分離上清與沉淀，對上清和沉淀進行SDS-PAGE。

1.9 MPB70-ESAT-6的反應性分析 采用Western blotting分析MPB70-ESAT-6的反應性。誘導后的表達菌→超聲破碎→裂解液上清→Ni-NTA Agarose柱純化→SDS-PAGE→轉膜→BSA封閉后，再依次進行如下反應：牛結核陽性血清→HRP標記羊抗牛IgG→聯苯胺反應。

2 結 果

2.1 融合基因擴增產物mpb70、esat-6及mpb70-esat-6 擴增結果如圖1所示。圖中可見mpb70、esat-6和mpb70-esat-6 DNA片段分別是545 bp、341 bp、841 bp，與預期大小相一致。

1-3: 分別為mpb70、esat-6和mpb70-esat-6 基因的 PCR產物; M: DNA Marker1-3: PCR products of mpb70, esta-6 and mpb70-esat-6 genes, respectively; M: DNA Marker /DL2000 圖1 mpb70, esat-6和mpb70-esat-6的PCR擴增Fig 1 PCR amplification of mpb70,esat-6 and mpb70-esat-6 genes

2.2 mpb70-esat-6的克隆與鑒定 mpb70-esat-6與載體pMD19連接，獲得了pMD-70-esat-6， 經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，電泳結果見圖2。圖中可見約2690 bp的pMD19和841 bp的mpb70-esat-6。序列測定后分析顯示，mpb70-esat-6 融合基因的大小為841 bp，與預期大小一致，而且沒有堿基的插入、缺失及替換現象，成功地得到了牛結核桿菌mpb70-esat-6融合基因。

2.3 原核表達質粒的構建與鑒定 mpb70-esat-6和載體pET28a(+)連接，構建了pET-70-esat-6，經BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，獲得了約5300 bp的pET28a(+)和841 bp的mpb70-esat-6(圖3)。

2.4 SDS-PAGE分析E.coliBL21(DE3)中的pET-70-esat-6經IPTG誘導各時間的表達結果如圖4所示。圖中可見mpb70-esat-6得到了表達，MPB70-ESAT-6的相對分子量約為27.2 ku，誘導后表達量明顯增加，4 h后達到最高，在超聲裂解液的上清和沉淀中均存在，說明MPB70-ESAT-6以可溶性和包涵體兩種形式獲得了表達，這種可溶性表達有利于后續的純化。而pET28a(+)E.coliBL21(DE3)中則沒有見到該蛋白的表達。

2.5 MPB70-ESAT-6的反應性分析 mpb70-esat-6融合基因表達的MPB70-ESAT-6融合蛋白Western blotting分析結果見圖5，圖中27 ku 處存在一條明顯的蛋白印跡帶，表明表達的MPB70-ESAT-6能夠與牛結核陽性血清發生反應，且有著良好的反應性。

1-2: pMD-70-esat-6的酶切產物; M: DNA Marker DL20001-2: Products of pMD-70-esat-6 digested by enzyme; M: DNA Marker DL2000圖2 重組質粒pMD-70-esat-6的酶切鑒定Fig 2 Restriction analysis map of pMD-70-esat-6

M1: DNA Marker DL2000; 1: pET-70-esat-6; 2: pET-70-esat-6的酶切產物; M2: λ DNA digested with Hind ⅢM1: DNA Marker DL2000; 1: pET-70-esat-6; 2: Products of pET-70-esat-6 digested by enzyme; M2: λ DNA digested with Hind Ⅲ圖3 原核表達質粒的酶切鑒定Fig 3 Restriction analysis map of pET-70-esat-6

1: pET-28a(+)在E.coli BL21中誘導7 h;2-9: 分別是pET-70-esat-6在E.coli BL21中誘導0～7 h; M: 蛋白質Marker; 10: pET-70-esat-6在E.coli BL21中誘導后裂解的沉淀;11: pET-70-esat-6在E.coli BL21中誘導后裂解的上清1: pET-28a(+) expression result in E.coli BL21 with IPTG induced 7 h, as control; 2-9: pET-70-esat-6 expression results in E.coli BL21 with IPTG induced 0～7 h, respectively; M: Protein Marker;10: Cleavage liquid precipitate of pET-70-esat-6 in E.coli BL21 with IPTG induced; 11: Cleavage liquid supernatant of pET-70-esat-6 in E.coli BL21 with IPTG induced圖4 mpb70-esat-6 在E.coli BL21中的表達Fig 4 mpb70-esat-6 fusion gene recombinant expression plasmid expressed by prokaryotic expression vector in E.coli BL21

1-3: MPB70-ESAT-6; M: 蛋白質Marker1-3: MPB70-ESAT-6; M: Protein Marker圖5 MPB70-ESAT-6 的Western blotting分析Fig 5 Western blotting analysis of the MPB70-ESAT-6 fusion protein

3 討 論

迄今為止，動物結核病一直在采取檢疫-隔離-淘汰的防制策略，但始終未能從根本上得以控制。究其原因，一方面是存在結核動物的漏檢情況，另一方面尚無實用的疫苗。因此，新型、安全、高效結核病疫苗和敏感、特異檢測抗原的研制，以及簡便、快速、易行診斷方法的建立則一直倍受注目。

在結核病免疫學診斷研究中，有報道指出，牛結核桿菌MPB70、MPB83、MPB63、ESAT-6和CFP10等可能是結核病血清學診斷最為有用的抗原[19]。MPB70、MPB83、ESAT-6、CFP10四種抗原在多重ELISA分析中的敏感性為74.2%，特異性為94.9%[15]，MPB70檢測的陽性血清抗體效價有50%達1∶64000[16]。MPB83/MPB70融合蛋白對自然感染的結核牛血清檢測的敏感性為63%，特異性為98%[17]。p22(主要是MPB70和MPB83的復合物)ELISA對赤鹿檢測的敏感性和特異性分別為99.02%和70.1%[18]。

研究發現，與ESAT-6相比，PE/PPE肽-ESAT-6融合蛋白的免疫應答增強，攻毒后，能誘導CD4+T細胞分泌IL-2+/IFN-γ+，且脾臟中的菌落形成單位低于ESAT-6[20]。ESAT-6 與IgG1 Fcγ的融合能夠靶向APC的FcγR，從而增強免疫原性[21]。可見，融合蛋白或多重抗原在結核病的診斷和疫苗的研究中有著良好的應用前景。

本研究利用45個核苷酸Linker將牛結核桿菌mpb70和esat-6兩個保護性抗原基因融合，通過(Gly4Ser)3的柔性肽將MPB70和ESAT-6連接并隔離，以防兩個蛋白在空間結構折疊時產生干擾。本研究成功地獲得了mpb70-esat-6融合基因，序列分析表明堿基序列準確無誤。由此構建了mpb70-esat-6的原核表達重組質粒，并在E.coli中表達了MPB70-ESAT-6，且具有良好的抗原反應性，為進一步研究MPB70-ESAT-6作為牛結核病的診斷抗原和亞單位疫苗奠定了基礎。