一株豬肺炎支原體的分離鑒定

潘建剛，陳波，周明光，徐高原

(武漢科前生物股份有限公司，武漢 430070)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起豬氣喘病的主要病原[1]，該病在世界范圍內廣泛流行，我國地方豬種和雜交豬種尤為易感，幾乎普遍存在，造成了重大損失。豬群一旦感染Mhp，便難以清除[2]，可繼發感染PRRSV、PCV2 等[3-4]，從而導致多種疫苗接種失敗。由于豬肺炎支原體對營養要求苛刻，使得其體外分離培養難度很大[5-6]；同時在分離過程中還易受豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)的影響[7]，給本病的研究工作帶來了困難。本試驗從全國部分豬場采集到的疑似豬支原體肺炎病變肺臟中成功分離獲得1株豬肺炎支原體，以期為豬支原體肺炎疫苗的研究提供必要條件和有利數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 疑似豬支原體肺炎的發病豬肺臟采集自全國部分豬場，肺臟的尖葉、心葉、中間葉或膈葉前緣有不同程度的對稱性病變，呈“肉樣變”、“胰樣變”，共12 份。

1.1.2 豬肺炎支原體培養基 由武漢科前生物股份有限公司制備。

1.1.3 細菌基因組DNA提取試劑盒 購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.4 試驗動物 3周齡仔豬，購自華農試驗種豬場，母豬未注射豬支原體肺炎疫苗，經IDEXX試劑盒檢測仔豬血清中豬肺炎支原體(Mhp)、豬圓環病毒( PCV2)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒( PRRSV) 抗體陰性。

1.1.5 豬肺炎支原體陽性血清 本實驗室從北京生泰爾生物科技有限公司購進的豬肺炎支原體J株制備兔抗豬肺炎支原體特異性血清，瓊擴效價為1∶32，批號為170502。

1.1.6 豬鼻支原體陽性血清 從中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心購進的豬鼻支原體BTS-7株制備兔抗豬鼻支原體特異性血清，瓊擴效價為1∶16，批號為170301。

1.1.7 攻毒用強毒株 豬肺炎支原體(濟南系強毒CVCC354株)，F3代，由武漢科前股份有限公司復壯、保管和供應。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 將采集的12份病料分別用含800 U/mL青霉素的PBS洗去血液和組織碎片，無菌操作剪取有豬喘氣病特征病變和將健康交界處的肺組織進行PCR鑒定和供分離培養。

1.2.2 病料PCR鑒定

1.2.2.1 病料DNA提取 取約0.5 g病料，剪碎后勻漿器加2.0 mL水研磨成糊狀，先3000 r/min離心5 min，上清再以13000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀用250 μL PBS重懸。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取重懸液DNA，-20 ℃以下保存備用。

1.2.2.2 PCR鑒定 PCR引物按參考文獻方法進行合成[8]。豬肺炎支原體引物序列：P1：5'- TTACAGCGGGAAGACC-3'；P2：5'-CGGCGAGAAACTGGATA-3'；PCR擴增體系：10×buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，引物P1(10 μM)1.0 μL，引物P2(10 μmol/L)1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，加注射用水至50 μL；反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳。預計擴增片段長度約為427 bp。

1.2.2.3 多重PCR鑒定 多重PCR引物按參考文獻方法進行合成[9-10]，引物序列：Mhp-f：5'-TTCAAAGGAGCCTTCAAGCTTC-3'；Mhr-f：5'-CGGGATGTAGCAATACATTCAG-3'；M-r：5'-AGAGGCATGATGATTTGACGTC-3'；多重擴增體系：10×buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，上游引物均為(10 μmol/L)0.8 μL，下游引物為(10 μmol/L)1.2 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，加注射用水至50 μL；反應條件為：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火50 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環，72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳。預計豬肺炎支原體擴增片段長度約為1000 bp；豬鼻支原體擴增片段長度約為1129 bp。

1.2.3 病原的分離 將病料研磨后過濾，接入含10%豬鼻支原體特異性血清、800 U/mL青霉素的豬肺炎支原體液體培養基中，置37 ℃培養。每間隔7日盲傳1次，每天觀察培養基顏色變化，前3代均加入10%豬鼻支原體特異性血清。在培養時，將培養基顏色發生改變，傳代可出現pH規律性下降的培養菌液進行鑒定，剩余培養菌液于-20 ℃以下凍存。

1.2.4 病原的PCR鑒定及測序 將經培養傳代分離的菌株提取基因組DNA，按1.2.2.2方法進行PCR 擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。回收產物送往擎科公司測序。

1.2.5 形態觀察 按常規方法對分離菌株進行瑞氏染色，普通光學顯微鏡下觀察菌體形態特征。

1.2.6 生化特性 將臨床分離株進行尿素酶活性測定；葡萄糖分解試驗；精氨酸水解試驗；三苯基氯化四氮唑( TTC)試驗；七葉苷水解試驗；甘露醇分解試驗；膜和斑形成試驗。生化實驗按參考文獻[11]方法進行。

1.2.7 血清學特性 生長抑制試驗：將直徑為6 mm的圓形濾紙片用未經稀釋的抗血清浸泡后放入無菌平板內，4 ℃干燥待用。吸取待檢菌株的菌液0.1 mL涂布于固體平皿中，放置37 ℃使瓊脂表面稍干燥，無菌夾取抗血清濾紙片貼于瓊脂表面，37 ℃培養10日。在低倍顯微鏡下觀察，當濾紙片周圍無菌落生長，出現抑制帶大于1.0 mm時，判為豬肺炎支原體陽性。

1.2.8 致病性分析 將分離菌株菌液分別經氣管注射3周齡仔豬4頭，5 mL/頭(109CCU)。另設4 頭條件相同的對照豬，各氣管注射培養基5 mL，作為對照。試驗豬、對照豬隔離飼養。每天觀察發病情況，并于注射后28 d全部剖殺，觀察肺部病變，根據Goodwin氏55分評分法對試驗仔豬的肺臟病變進行打分[12]。取部分病變組織置于10%的甲醛溶液固定，隨后進行石蠟包埋、切片和HE 染色等一系列病理切片制作流程后，在顯微鏡下讀片，觀察組織病理變化，了解菌株對仔豬的毒力，記錄試驗結果。

1.2.9 免疫原性試驗 將分離株菌株濃縮純化、滅活后與佐劑混合制備滅活疫苗，將疫苗分別頸部肌肉注射3周齡仔豬4頭，2.0 mL/頭(109CCU)，接種后21 d，按相同途徑、相同劑量二免。另外4頭不接種作為對照，同條件下飼養。二免14 d，連同對照豬4頭，各氣管注射豬肺炎支原體(濟南系強毒CVCC354株)凍干肺組織毒5 mL(含0.5 g病肺組織)，每日觀察仔豬臨床癥狀，攻毒后28 d，撲殺全部仔豬。按55分法對各仔豬的肺部喘氣病病變進行評分，計算肺炎病變減少率。

2 結 果

2.1 病料PCR鑒定 12份病料，其中4份病料檢測出有豬肺炎支原體(圖1)。

M: DL2000 DNA Marker; 1: 陽性對照;2: 陰性對照; 3-14: 病料樣品M: DL2000 DNA Marker; 1: Positive control;2: Negative control; 3-14: Tissue samples圖1 肺組織PCR檢測結果Fig 1 PCR results for the lung tissues

2.2 病料多重PCR鑒定 4份陽性病料經過多重PCR檢測都能擴增出長度約為1000 bp豬肺炎支原體目的片段，但其中有3份陽性病料還擴增出長度約為1129 bp豬鼻支原體目的片段(圖2)。

M: DL2000 DNA Marker; 1: 陰性對照;2: 豬鼻支原體陽性對照; 3: 豬肺炎支原體陽性對照; 4: 豬鼻支原體陽性對照、豬肺炎支原體陽性對照; 5-8: 病料樣品M: DL2000 DNA Marker; 1: Negative control; 2: Positive control(Mhr); 3: Positive control (Mhp); 4: Positive control (Mhr、Mhp); 5-8: Tissue samples圖2 陽性病料多重PCR檢測結果Fig 2 Multiple PCR results for the positive samples

2.3 病原分離 取只含有豬肺炎支原體的1份病料，研磨后進行分離、培養傳代，傳至第3代時，培養基顏色發生改變，接著傳至第8代，菌種能在培養基上穩定生長，pH規律性下降，生長時間穩定在3～4 d，活菌滴度可達109CCU/mL。

2.4 病原PCR鑒定 菌株擴增結果與預期片段427 bp大小一致(圖3)。測序結果通過NCBI BLAST比對，分離株P36基因序列與豬肺炎支原體J株和168株同源性分別達99%以上，從分子水平上證明了分離的菌株為豬肺炎支原體。

M: DL2000 DNA Marker; 1: 陽性對照; 2: 陰性對照; 3: 分離菌株M: DL2000 DNA Marker; 1: Positive control; 2: Negative control; 3: Isolated strain圖3 菌液PCR檢測結果Fig 3 PCR results for the bacterial fluid

2.5 形態學特性 分離豬肺炎支原體菌株經過瑞士染色，鏡檢，觀察到特征性的多形態，有點狀、環狀、球狀和兩極狀(圖4)。

圖4 瑞士染色結果(100×)Fig 4 The results of wright's stain(100×)

2.6 生化特性 分離菌株生化反應與豬肺炎支原體生化特性相符(表1)。

表1 分離菌株生化試驗Tab 1 The biochemical tests of isolated strain

“ +” 陽性; “ -” 陰性

“ +” Positive; “ -” Negative

2.7 生長抑制 吸有抗血清的濾紙片周圍出現了直徑為2.6 mm的抑菌圈，驗證分離的菌株為豬肺炎支原體。

2.8 致病性 攻毒組豬氣管內注射5 mL分離株菌液后，大部分豬出現咳嗽、喘氣等臨床癥狀，對照組無癥狀(表2)；剖檢攻毒豬，發現肺臟的尖葉、心葉前端有部分對稱性的肉樣變化(02號和04號攻毒豬肺臟如圖5所示)；攻毒組豬肺臟病變組織制片經過HE染色后，在顯微鏡下觀察，肺間質增寬、增厚，肺泡內有大量炎性細胞浸潤(02號和04號攻毒豬肺臟病變組織切片如圖6所示)，以上說明分離的豬肺炎支原體具有一定的致病性。

2.9 免疫原性 免疫組豬臨床觀察基本正常，對照組豬有支原體肺炎典型咳嗽、喘氣的臨床癥狀，根據肺炎病變打分，免疫組平均肺炎病變減少74.51%(表3)；剖檢試驗豬，免疫組和對照組肺部有明顯差異，免疫組豬肺組織病變不明顯，對照組病變嚴重，肺臟的尖葉、心葉前緣有嚴重的對稱性病變，呈“肉樣變”、“胰樣變”(12號免疫組豬，18號對照組豬肺臟如圖7)，以上說明分離的豬肺炎支原體具有很好的免疫原性。

表2 臨床癥狀和肺病變得分結果Tab 2 The clinical manifestation and score of pathologe variation of piglets lung

圖5 肺臟臨床解剖圖Fig 5 Clinical anatomy of lung

圖6 肺臟病理切片觀察(HE 40×)Fig 6 Observed of pathophysiology of lung(HE 40×)

組別耳號 臨床癥狀肺炎病變得分肺部病變平均得分平均肺部病變減少率免疫組11攻毒后22天出現輕微咳嗽612無咳嗽、喘氣等癥狀313無咳嗽、喘氣等癥狀014無咳嗽、喘氣等癥狀43.2574.51%對照組15攻毒后20天出現輕微咳嗽1016攻毒后21天出現輕微咳嗽717攻毒后16天出現咳嗽、喘氣1618攻毒后15天出現咳嗽、喘氣1812.75-

圖7 肺臟臨床解剖圖Fig 7 Clinical anatomy of lung

3 討論與結論

豬肺炎支原體感染豬時，常伴有豬鼻支原體混合感染，從豬體內進行豬肺炎支原體的分離非常困難。現有疫苗菌株分離年代都比較久遠，保護效果有一定的降低。本研究通過采集疑似豬支原體感染的組織病料，經過PCR鑒定，多重PCR檢測，將陽性病料接到豬肺炎支原體液體培養基進行分離，成功分離到一株菌株。分離的菌株經測序、形態觀察、生化特性、血清學特性鑒定為豬肺炎支原體，此株豬肺炎支原體與常用的疫苗菌株同源性好，并且是從最近發病的豬場分離而來，為潛在的疫苗菌株。

在致病性試驗中，分離菌株菌液進行攻毒，發現分離菌株經過傳代仍具有一定的毒力，可致仔豬產生咳嗽等支原體肺炎典型的臨床癥狀，剖檢能觀察到肺部肉變，病理切片顯示感染豬均表現不同程度的間質性肺炎；在免疫原性試驗中，分離株制備滅活疫苗免疫仔豬后攻毒，免疫組肺炎病變平均減少74.51%，分離菌株免疫原性良好。對仔豬的致病性試驗和免疫原性試驗可以證明，分離株適合作為滅活疫苗的制苗用菌株。