分散固相萃取結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛可食性組織中泰地羅新殘留量

吳劍平，張婧，貢松松，嚴(yán)鳳，潘娟,黃士新

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

泰地羅新(tildipirosin)，國(guó)際化學(xué)名為20-脫氧-23脫氧-5-氧-[3,6-二脫氧-3-(二甲氨基)- β-D-吡喃葡萄糖基]-20，23-二-1-哌啶基泰樂(lè)內(nèi)脂，CAS No：328898-40-4，分子式為C41H71N3O8，分子量為734.02，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。泰地羅新是繼替米考星和乙酰異戊酰泰樂(lè)菌素之后，又一種由泰樂(lè)菌素半合成制備的新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。荷蘭英特威國(guó)際有限公司(Intervet International BV)最早研發(fā)了該藥物，于2011 年經(jīng)歐洲藥物管理局(European medicinesagency, EMA)的審核，在歐盟國(guó)家批準(zhǔn)上市銷售[1-2]。泰地羅新主要通過(guò)作用于細(xì)菌核糖體50s亞基，阻斷mRNA 位移，使得細(xì)菌的肽鏈合成和延長(zhǎng)受阻，影響其蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到抑菌的目的。其主要用于治療由副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等細(xì)菌引起的呼吸道疾病，其比泰樂(lè)菌素在抑制豬、牛呼吸道致病菌展現(xiàn)出更好的效果[3-5]。該藥吸收迅速，半衰期長(zhǎng)，生物利用度高，性質(zhì)穩(wěn)定，具有較好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。國(guó)內(nèi)近期已有廠商引進(jìn)研發(fā)了該藥，因此,有必要盡快制定該藥在豬、牛等動(dòng)物可食性組織中的殘留量檢測(cè)方法。

目前，檢測(cè)大環(huán)內(nèi)脂類抗生素檢測(cè)方法中的紫外分光光度法、熒光法等由于受基質(zhì)干擾較嚴(yán)重不適用于殘留檢測(cè)，液相色譜法雖能較好的分離基質(zhì)[6-8]，但是后端的紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器的靈敏度不足，難以適應(yīng)殘留檢測(cè)的需要[9]。本實(shí)驗(yàn)室之前也建立了以靜電場(chǎng)軌道阱高分辨液質(zhì)解析泰地羅新注射液中的有關(guān)物質(zhì)[10]，但高分辨質(zhì)譜在定量方面并不如其在定性方面的優(yōu)勢(shì)明顯[11]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物可食性組織中的藥物殘留量具有靈敏度高，特異性好的特點(diǎn)[12]，有研究表明用該方法檢測(cè)豬可食性組織中的泰地羅新檢測(cè)限可達(dá)到10 μg/kg[13]。分散固相萃取相比傳統(tǒng)的固相萃取柱，前處理具有成本低，速度快，便于操作的特點(diǎn)[14]，本研究結(jié)合分散固相萃取技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)牛可食性組織中的泰地羅新殘留量檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。

圖1 泰地羅新化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of tildipirosin

1 材料和方法

1.1 儀器 Ultimate 3000雙三元超高效液相色譜、Excalibur控制軟件、串聯(lián)四極桿質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源(TSQ Quantiva)、Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等(Thermo, 美國(guó))、高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER)；電子天平(AL204，梅特勒-托利多儀器有限公司)；減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(B-490，BUCHI)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。

1.2 材料、藥品與試劑 C18分析柱(Thermo Hypersil gold 50×2.1 mm，1.9 μm)，泰地羅新對(duì)照品(上海同仁藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130503，99.1%)，無(wú)水硫酸鎂(分析純)，氯化鈉(分析純)，正己烷(色譜純)，乙腈(色譜純)，酸性氧化鋁(100～200目)，乙腈、甲醇、甲酸(色譜純)；去離子水(電阻率≥18 MΩ·cm)；高純氮、高純氬(純度均為99.999%)。

1.3 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil gold 50×2.1 mm，1.9 μm，柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL/min,進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相：A為0.1%甲酸，B為乙腈，采用梯度洗脫程序(表1)，所得特征離子質(zhì)量色譜圖如圖2所示。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Procedure of gradient elution

1.4 質(zhì)譜條件 使用Thermo Fisher公司的TSQ Quantiva串聯(lián)四極桿質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源質(zhì)譜檢測(cè)器，條件如下：ESI+模式，源電壓3500 V，鞘氣(Sheath gas)壓力344 kPa，輔助氣(Aux gas)流速5 L/min，吹掃氣(Sweep gas)流速0.3 L/min，離子傳輸管(Ion transfer tube)溫度 350 ℃，霧化器(Vapourizer)溫度350 ℃，檢測(cè)模式為選擇反應(yīng)監(jiān)控(Selected reaction monitor，SRM)，碰撞氣壓力0.2 Pa，Q1段分辨率設(shè)為半峰寬0.7，Q2段分辨率設(shè)為半峰寬0.7，目標(biāo)化合物反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)控(SRM)參數(shù)Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair for tildipirosin

帶*為定量離子對(duì)

1.5 前處理?xiàng)l件 取2.00 g樣品置于50 mL試管中，加入50 %乙腈溶液10 mL，渦旋混勻后加入5.00 mL正己烷和無(wú)水硫酸鎂與氯化鈉各2 g，振蕩提取10 min，8000 r/min離心5 min，用微量取液器準(zhǔn)確吸取中間乙腈層清液0.50 mL至離心管中備用。備用液中加入1.50 mL的0.1%甲酸溶液和0.20 g酸性氧化鋁粉末，渦旋均勻后12000 r/min離心3 min，取上清液過(guò)0.22 μm尼龍濾膜后裝入棕色進(jìn)樣瓶上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分別稱取(2.00±0.02)g牛空白組織各3份于具塞離心管中，其中一份作為空白基質(zhì)，另外2份依次加入己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成含泰地羅新藥濃度為5 μg/kg 和10 μg/kg的組織樣品。按照1.5項(xiàng)前處理方法處理后，按1.3項(xiàng)與1.4項(xiàng)儀器條件進(jìn)樣分析，所得特征離子質(zhì)量色譜如圖2所示，依據(jù)信噪比S/N>3作為檢測(cè)限，信噪比S/N>10作為定量限，結(jié)果表明方法的檢測(cè)限可達(dá)5 μg/kg，定量限可達(dá)10 μg/kg。據(jù)歐盟最新規(guī)定[15]，泰地羅新在牛肉中的最大殘留限量(MRL)為400 μg/kg，在牛脂肪中為200 μg/kg，在牛肝中為2000 μg/kg，在牛腎中為3000 μg/kg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法靈敏度符合要求。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 稱取2.00±0.02 g牛空白組織各5份，按1.5項(xiàng)方法處理后獲得相應(yīng)組織空白基質(zhì)溶液。另精密稱定標(biāo)準(zhǔn)品10 ±0.5 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，得100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用0.1%甲酸稀釋至100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液。取適量標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液用0.1%甲酸溶液稀釋至1 ng/mL溶劑標(biāo)準(zhǔn)品溶液，另取適量標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液用空白基質(zhì)溶液稀釋至1 ng/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將1 ng/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)品溶液基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液按1.3項(xiàng)與1.4項(xiàng)的儀器條件進(jìn)樣測(cè)試，所得面積均值和RSD%如表3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛肉、牛脂肪、牛肝和牛腎的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液與溶劑標(biāo)準(zhǔn)品相比都有不同程度的基質(zhì)抑制作用，因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量校正。

(a) 牛肉空白樣品圖；blank bovine muscle; (b) 牛脂肪空白樣品圖；blank bovine fat; (c) 牛肝空白樣品圖；blank bovine liver;(d)牛腎空白樣品圖；blank bovine kidney;(e) 牛肉空白樣品添加10 μg/kg；10 μg/kg added in blank bovine muscle; (f) 牛脂肪空白樣品添加10 μg/kg；10 μg/kg added in blank bovine fat;(g) 牛肝空白樣品添加10 μg/kg；10 μg/kg added in blank bovine liver;(h) 牛腎空白樣品添加10 μg/kg；10 μg/kg added in blank bovine kidney;圖2 牛組織中添加泰地羅新實(shí)驗(yàn)特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 2 Typical SRM chromatogram of tildipirosin added in bovine tissues

樣品Sample濃度/(ng·mL-1)Concentration面積均值(n=5)Average areaRSD/%溶劑標(biāo)準(zhǔn)品11217661.2牛肉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品1868362.1牛脂肪基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品1901562.5牛肝基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品11013623.8牛腎基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品1956472.9

2.3 線性定量范圍 將100 μg/mL的泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用0.1%甲酸溶液稀釋至1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，再以各種牛組織按1.5項(xiàng)前處理方法處理所得的空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間溶液獲得1、2、5、20、50、100 ng/mL系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液，按1.3項(xiàng)與1.4項(xiàng)儀器條件進(jìn)樣檢測(cè)。將所得定量通道色譜圖積分后面積以Y表示,進(jìn)樣濃度以X表示，所得回歸曲線結(jié)果如表4所示，其線性相關(guān)系數(shù)r都大于等于0.995。實(shí)驗(yàn)表明，該方法檢測(cè)泰地羅新在4種牛組織基質(zhì)中10～1000 μg/kg添加含量范圍內(nèi)線性良好。

2.4 方法準(zhǔn)確度與精密度 分別取3批空白牛肉、牛脂肪、牛肝和牛腎中添加定量限(LOQ)、半最大殘留限量(1/2MRL)、最大殘留限量(MRL)和2倍最大殘留限量(2MRL)4個(gè)不同含量水平的泰地羅新藥物，進(jìn)行添加回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)。其中牛肉添加量分別為10、200、400、800 μg/kg；牛脂肪添加量分別為10、100、200、400 μg/kg；牛肝中添加量分別為10、1000、2000、4000 μg/kg；牛腎中添加量分別為10、1500、3000、6000 μg/kg。其中由于牛肝和牛腎中的MRL數(shù)值較高，所添加的含量超出了方法的線性定量范圍，因此，在按1.5項(xiàng)前處理方法處理后還需再用0.1%甲酸稀釋10倍進(jìn)樣分析。所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加回收率在60%～110%范圍內(nèi)，RSD<10%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。

表4 牛組織中添加泰地羅新的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 4 Standard curve of tildipirosin added in bovine tissure

表5 方法準(zhǔn)確度與精密度Tab 5 Accuracy and precision of the method

續(xù)表

2.5 方法選擇性的驗(yàn)證 選擇空白牛肉、牛脂肪、牛肝和牛腎各20個(gè)空白樣品，按優(yōu)化條件進(jìn)行處理后上機(jī)測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)有假陽(yáng)性結(jié)果，表明該方法的選擇性良好。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取液提取效率研究 在4種基質(zhì)中嘗試了多種提取液，包括純乙腈、水、50%乙腈、正己烷、異辛烷提取。2 g空白試樣中加入1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液 100 μL，分別加入上述提取液進(jìn)行振蕩提取，之后采用1.5項(xiàng)中前處理?xiàng)l件進(jìn)行凈化，測(cè)得結(jié)果如表6所示。測(cè)試結(jié)果表明，泰地羅新屬于極性較大的化合物(LogP=4.05)，在水和50%乙腈溶液中的提取效率接近90%，在純乙腈溶液中的提取效率接近70%，而在正己烷或異辛烷這類極性小的溶劑中幾乎不溶，因此，選擇50%乙腈進(jìn)行提取，正己烷可用來(lái)進(jìn)行脫脂而不會(huì)造成目標(biāo)藥物過(guò)多的損失，而異辛烷由于極性太小雖然不會(huì)損失目標(biāo)物但是除酯效果不如正己烷，因此，最終選擇正己烷脫脂。

表6 牛組織中泰地羅新提取效率研究Tab 6 Research on extraction rate of tildipirosin added in bovine tissure

3.2 分散相基質(zhì)的選擇 牛組織中的干擾雜質(zhì)主要以蛋白質(zhì)和磷脂為主，主要通過(guò)無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉進(jìn)行鹽析，其對(duì)基質(zhì)中的血細(xì)胞之類的生物雜質(zhì)也有一定的破壞和沉降能力。乙腈在提取的同時(shí)也具有破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成沉淀的作用。皮脂和肝臟中不但有蛋白質(zhì)，還有大量的脂肪會(huì)干擾后續(xù)的檢測(cè)，原本嘗試使用C18粉末吸附，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在吸附脂肪的同時(shí)會(huì)造成提取效率的大幅下降，推測(cè)是C18粉對(duì)目標(biāo)化合物也有較強(qiáng)的吸附能力，因?yàn)樵?.1項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)正己烷中泰地羅新溶解性很小，而脂肪在其中的溶解度較高，因此，采用正己烷脫脂。最后，通過(guò)高速離心可以將蛋白、磷脂、血細(xì)胞等沉降至下層，未溶解的脂肪粒會(huì)漂浮在正己烷層的表面，只要吸取中間的乙腈層即可獲得富含目標(biāo)物的提取液。

本研究建立了檢測(cè)牛肉、牛脂肪、牛肝和牛腎中泰地羅新殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。前處理使用分散固相萃取法，液相部分使用反相色譜柱進(jìn)行分離，三重四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行定性定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法的最低檢出限為5 μg/kg，最低定量限為10 μg/kg，在10～1000 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.995)，添加回收率在60%～110%，RSD<10%，表明該方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度與精密度。