加米霉素對照品標定方法的建立

張聰，姚路路，侯林，樊麗博，楊會鮮，周德剛，張曉會

(1.國家獸用藥品工程技術研究中心,河南洛陽 471000；2.洛陽惠中獸藥有限公司,河南洛陽 471000)

加米霉素是法國梅里亞公司開發研制的新一代半合成十五元氮雜環大環內酯類抗菌藥物，其注射液于2017年通過農業部進口獸藥注冊在我國上市銷售，用于治療和預防由溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌等主要病原菌引起的牛呼吸系統疾病[1]。目前國內有多家單位開展加米霉素及注射液的仿制研究[2-4]，但加米霉素法定對照品在國際和國內并無單位提供，困擾了加米霉素原料及其注射液的質量控制，本文研究建立了加米霉素對照品的標定方法，為其對照品的標定提供技術依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜系統(Waters e2695型HPLC；2998型PDA檢測器；Empower 3色譜工作站軟件)，美國Waters公司；XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國Waters公司；AB265-S電子分析天平，梅特勒托利多公司；Seven easy型酸度計，梅特勒托利多公司；GZX-9070MBE型電熱鼓風干燥箱，SX2-2.5-10型箱式電阻爐，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；磷酸氫二鈉、磷酸為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水。

1.2 試藥 加米霉素對照品原料，由洛陽惠中獸藥有限公司制備。

2 方法與結果

2.1 結構確證

2.1.1 采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質譜(MS)、核磁共振波譜(NMR)對加米霉素原料進行結構確認 測試方法及條件：UV測定，供試品用乙醇溶解，濃度為0.011 mg/mL，掃描范圍190～400 nm；IR測定，采用KBr壓片法，供試品與KBr的比例約為1∶200；1H-NMR測定為500 MHz，13C-NMR測定為500 MHz，供試品采用CDCl3溶解；MS測定，離子化方式為ESI+。

結構確認結果如下：UV λmax：204 nm；IR v：3534、2969、2937、2876、2831、2795、1735、1637、1458、1421、1380、1349、1295、1279、1249、1166、1135、1109、1094、1075、1058、1016、1004、983 cm-1；ESI-MSm/z：777.54 [M+H]+；1H NMR(CDCl3)：δ 0.89, 0.98, 0.99, 1.08, 1.22, 1.30, 1.54, 1.70, 1.91, 2.01, 2.30, 2.74, 3.01, 3.14, 3.29 3.55, 3.62, 4.08, 4.23, 4.38, 5.00。13C NMR(CDCl3)：δ177.60, 105.09, 96.47, 77.92, 77.30, 7.05, 76.79, 75.31, 74.27, 72.79, 70.39, 69.23, 65.60, 64.97, 59.27, 49.37, 46.87, 42.48, 40.37, 34.97, 32.53, 28.95, 22.06, 21.55, 21.16, 17.82, 16.02, 15.23, 14.54, 12.92, 12.09, 11.35。以上數據與文獻[3,5]報道數據一致，表明對照品原料化學結構與加米霉素相同。

2.1.2 采用X射線單晶衍射法對加米霉素原料進行結構確認 單晶培養條件：取對照品原料0.1 g，置潔凈容器內，加乙腈溶解，室溫放置，緩慢揮發溶劑至晶體長成。

對照品原料X射線單晶衍射測定結構單元見圖1，絕對構型與加米霉素相同。

a含溶劑的結構單元 b去除氫的結構單元a Structural Unit Containing Solvents b Structural unit for hydrogen removal圖1 對照品原料結構單元 Fig 1 Structure Unit of reference material

2.2 HPLC純度檢查

2.2.1 色譜條件 參考歐洲藥典EP8.0版阿奇霉素有關物質檢查方法[6]并進行優化，采用Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)色譜柱；流動相A為0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液(稀磷酸調pH值至8.9)-甲醇-乙腈(90∶2.5∶7.5)，流動相B為0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液(稀磷酸調pH值至8.9)-甲醇-乙腈(28∶18∶54),線性梯度洗脫，柱溫30 ℃；流速為1.0 mL/min，檢測波長為205 nm。

2.2.2 供試品測定 稱取對照品原料適量，加稀釋液[1.73 g/L磷酸二氫銨溶液(氨水調pH值至10.0)-甲醇-乙腈(35∶35∶30)]溶解并稀釋制成每1 mL中約含10 mg的溶液，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。扣除保留時間4 min前的溶劑色譜峰，按峰面積歸一化法計算純度，結果見圖2和表1。

表1 純度測定結果Tab 1 The results of purity test

圖2 對照品原料純度測定色譜圖Fig 2 The chromatogram of reference material Purity test

2.3 干燥失重 按《中國獸藥典》2015年版一部[7]干燥失重測定法(附錄0831)測定，結果見表2。

2.4 熾灼殘渣 按《中國獸藥典》2015年版一部[7]熾灼殘渣測定法(附錄0841)測定，結果見表3。

表2 干燥失重測定結果Tab 2 The results of Loss on drying

表3 熾灼殘渣測定結果Table 3 The results of residue on ignition

2.5 定量賦值 加米霉素對照品原料定值采用國際通用的質量平衡法確定含量，同時采用定量NMR技術對質量平衡法賦值準確性進行驗證。

2.5.1 質量平衡法賦值結果 含量(%)=純度×(1-干燥失重-熾灼殘渣)×100%，結果為99.93%×(1-1.05%-0.10%)×100%=98.8%。

2.5.2 定量NMR法驗證結果 依據《中國藥典》2015年版四部[8]通則0441核磁共振波譜法，試驗采用內標法，以馬來酸作為內標，樣品用氘代乙醇溶解后，以加米霉素1H譜中的2.66(3H)信號峰與內標物1H譜中的6.26(1H)信號峰(圖3)計算供試品的含量，定量NMR法含量測定結果為98.3%。

圖3 加米霉素定量核磁共振光譜圖Fig 3 The spectrogram of Quantitative nuclear magnetic resonance

2.6 對照品原料穩定性考察 加米霉素對照品原料，用安瓿瓶分裝，50 mg/瓶，放入藥品穩定性試驗箱中，在(40±2)℃、相對濕度75%±5%條件下放置6個月，分別于第1、2、3、6月取樣，對樣品性狀、熔點、純度進行檢查，結果見表4。

表4 穩定性考察結果Tab 4 The results of stability investigation

3 討論與結論

3.1 加米霉素結構確證 加米霉素為十五元氮雜環大環內酯類化合物，化學結構中具有較多的手型碳原子，因此,單純采用核磁共振方法難以確定每個手型中心的絕對構型，本研究通過溶劑結晶方法培養得到加米霉素單晶，采用X-射線單晶衍射方法對加米霉素的絕對構型進行了測定。

3.2 質量平衡法賦值 本研究按質量平衡法對本批加米霉素對照品原料進行了含量定值[9]。根據質量平衡法原理，標準品含量(%)=[100%-水分(%)-殘留溶劑(%)-無機雜質(%)]×純度(%)，當用干燥失重方法可將標準品中的水分和殘留溶劑全部揮發出來并使供試品達到恒重時，本公式中的水分和殘留溶劑的測定結果可用干燥失重結果代替[10]。加米霉素對照品原料最后采用丙酮-水系統進行精制，在105 ℃能全部揮發出去，試驗證明加米霉素對照品原料在該溫度能很快干燥至恒重，說明水分和有機溶劑能完全揮發，可用干燥失重結果代替水分和殘留溶劑的測定。

3.3 含量定值 為了準確標定加米霉素對照品原料的含量，采用了兩種不同原理的方法進行測定。由于原研公司加米霉素質量標準并未公開，根據其結構特征，參考泰拉霉素質量標準[11]及各國家阿奇霉素藥典標準[6,12]，本研究建立了加米霉素HPLC純度檢測方法，并對采用的方法進行了方法學驗證，以確保純度檢測結果的準確性。結果表明質量平衡法結果與定量NMR法結果相對偏差為0.3%，兩種方法標定結果一致。

本批加米霉素對照品原料的結構鑒定結果與其結構相符合，純度大于99%(HPLC法)，證明該批原料可以用于加米霉素對照品的制備。采用質量平衡法測得的加米霉素對照品原料含量為98.8%，用定量NMR法測得的結果為98.3%，兩種方法測定結果差異較小，說明本批加米霉素對照品原料賦值結果準確，可作為加米霉素原料及其制劑研制過程中對照品使用。