牛欄山二鍋頭酵母菌多樣性研究及其代謝產物分析

王 勇

（北京順鑫農業股份有限公司 牛欄山酒廠，北京 101301）

酵母菌是一群單細胞的真核微生物，與人類的關系密切，是工業上最重要，應用最廣泛的一類微生物，在釀造、食品、醫藥、工業等方面占有重要地位。我國白酒的發酵過程是依靠酒曲及環境中多種微生物共同作用的固態混合發酵過程，其中酵母菌在發酵過程中起主導作用[1]。開放的生產環境使得酵母菌在釀造過程中呈現了豐富的多樣性，不同酵母菌的次級代謝產物也往往與釀造過程中呈香呈味物質緊密相關。

在牛欄山二鍋頭釀造過程中，酵母菌種類較多，如魏金旺[2]研究表明，牛欄山釀造過程中共有13種酵母菌參與，周森等[3]利用傳統分離結合高通量測序計數確定了牛欄山二鍋頭中生香酵母和釀酒酵母在發酵前期數量快速增長的變化規律。目前，對于白酒中酵母菌揮發性代謝產物研究主要采用氣相色譜（gas chromatography，GC）和氣質聯用技術（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS），如楊強等[4]利用氣相色譜從小曲酵母中篩選出2株產乙酸乙酯能力較強的酵母菌；王曉丹等[5]利用氣質聯用法篩選40株形態不同酵母菌，最終篩選出兩株產酯能力較強的酵母。而在牛欄山釀造過程中，酒醅中的酵母菌在釀造過程中具體代謝能力及功能作用尚不明確。因此，本研究利用傳統微生物分離方法，從牛欄山清香型白酒發酵酒醅中分離獲得多種酵母菌，通過對其26S rDNA D1/D2區測序分析，對分離酵母菌進行鑒定，并利用高粱和酒醅兩種培養基，模擬了酵母菌發酵過程，分別采用氣相色譜（GC）和氣質聯用（GC-MS）分析不同種酵母菌可揮發性代謝產物，旨在獲取不同酵母菌產香能力，解析牛欄山二鍋頭風味，為今后特色基酒開發及基酒質控提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

清香型白酒發酵酒醅：北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠。

1.1.2 化學試劑

三氯甲烷、異丙醇、氯仿、醋酸鉀、無水乙醇、葡萄糖（均為分析純）：北京化工廠；乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、酵母膏、瓊脂（均為生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；α-淀粉酶（3 700 U/g）：奧博星生物技術有限責任公司；糖化酶（10萬U/g）：江蘇博立生物制品有限公司。

1.1.3 培養基

酵母分離培養基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，水1 L，115℃滅菌30 min，倒平板前加入20 mg/L氯霉素。

酵母浸出粉葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YEPD）培養基：蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，115℃滅菌30min，接菌前加入20 mg/L氯霉素。

高粱發酵培養基：高粱粉碎后按料水比1∶4（g∶mL）與水混勻，煮沸后紗布過濾去除液體，固體中加入液化酶，90℃保溫1 h，隨后冷卻至60℃加入糖化酶，保溫糖化2 h，攪拌均勻后，稱取100g于500mL磨口三角瓶中，115℃滅菌30 min，接菌前加入1 mL無水乙醇[6]。

酒醅發酵培養基：稱取大茬發酵3 d酒醅50 g于250 mL磨口三角瓶中，115℃滅菌30 min，接菌前加入1 mL無水乙醇。

1.2 儀器與設備

SC-1100ⅡA2型生物安全柜：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；C1000快速梯度基因擴增儀、PowerpacBasic基礎型水平電泳儀、GelDoc XR+BIO-RAD全自動凝膠成像儀：美國Bio Rad公司；1-14k高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SPX-320型生化培養箱：寧波江南儀器廠；KQ250DE數控超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；7890B氣相色譜儀、7890B-5977B氣質聯用儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 生香酵母分離

分離：分別取牛欄山清香型白酒發酵5d、7d、10d酒醅，按四分法混合取樣后，稱取10 g混合酒醅于90 mL無菌水混勻，擬定為10-1濃度，吸取1 mL于9 mL無菌水中，為10-2，依次稀釋為10-3、10-4、10-5梯度。吸取不同梯度液0.1 mL，分別涂布分離培養基平板中，28℃培養24～48 h[7]。

篩選：根據酵母菌形態，隨機挑取平板內形態差異較大酵母菌，挑取的菌落接種到YEPD培養基中，培養3 d后進行分子鑒定及甘油凍存[8-9]。

1.3.2 分子生物學鑒定

挑取少量活化的菌體，于已滅過菌的1.5 mL離心管內；加入100 μL裂解液（100 mmol/L Tris，30 mmol/L EDTA，0.5%SDS，pH8.0，115℃滅菌30min備用）；100℃水浴15min；加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸鉀溶液，冰浴60 min；4℃條件下13 000 r/min離心5 min，取上清液200 μL至0.5 mL離心管中；加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），劇烈振蕩10min，13 000 r/min離心15 min，移取100 μL上清液至0.5 mL離心管中；加入100 μL預冷的異丙醇，混勻后-20℃條件下放置20 min；13 000 r/min離心15 min，棄去上清；用體積分數為70%的酒精洗滌沉淀兩次；沉淀過夜自然干燥；加入50 μL已滅菌的超純水，室溫條件下溶解1 h，-20℃條件下備用。

對所提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）測序，測序引物及反應條件如表1所示。PCR產物送北京博邁德基因技術有限公司測序后，用Chromas軟件分析測序質量，去除峰圖不可靠的部分，用BioEdit軟件對DNA正反向序列進行拼接和校正，校正后在美國國家生物技術信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation，NCBI）網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進行同源序列搜索，比較該菌株在序列上親緣關系最近的已知信息，包括模式菌株與實驗菌株的堿基差異，近緣模式菌株GenBank序列號，利用軟件MEGA5.10對所有序列進行比對后，刪除兩端未對齊的堿基生成進化樹，并進行1 000次的Bootstrap method檢驗。采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法顯示進化樹，判斷待測菌株的分類地位[10]。

表1 PCR引物及反應條件Table1 PCR primers and reaction conditions

1.3.3 酵母菌高粱發酵培養基產物揮發性物質測定

將鑒定的酵母菌活化后，接入液體富集培養基，30℃、120 r/min培養3 d，吸取1 mL培養液接入高粱發酵培養基中混勻，5 mL 2.61 mol/L H2SO4發酵栓封口，30℃靜置培養5 d后，加入體積分數為60%的乙醇溶液400mL進行串蒸，接取串蒸液100 mL，以未添加酵母菌液固體培養基為對照，利用氣相色譜（gas chromatography，GC）法對蒸餾液揮發性物質進行定量分析。

氣相色譜條件：CPwax57色譜柱（50m×0.25mm×0.2μm）；進樣口溫度250 ℃；進樣量0.8 μL；分流比=30∶1；控制方式流量；檢測器溫度280℃；柱流速1 mL/min；空氣流量300 mL/min；氫氣流量30 mL/min；尾吹氣流量25 mL/min；柱箱溫度：35℃保持3min，以1℃/min升至50℃，再以20℃/min升至200℃，保持15 min。

1.3.4 酵母菌酒醅發酵產物揮發性物質的測定

吸取1 mL不同酵母培養液接入酒醅發酵培養基中充分混勻，5 mL 2.61 mol/L H2SO4發酵栓封口，28℃靜置培養8 d后，拔去發酵栓，加入50 mL無水乙醇，常溫200 W超聲萃取40 min后，吸取上清5 mL，12 000 r/min離心20 min，0.22μm濾膜過濾后利用氣質聯用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對揮發性物質進行分析。

GC條件：進樣口溫度250℃，載氣氦氣（He），流速2mL/min。進樣量1μL，不分流進樣，DB-FFAP色譜柱（60m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序：50℃恒溫2 min，以4℃/min的速度升溫至230℃，保持15min。MS條件：電子電離（electronicionization，EI）源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍30.00～350.00 amu[13-14]。

以丙酸辛酯（300 μg/L）作為酯類物質內標，薄荷醇（200μg/L）作為醇、醛、酚類物質檢測內標，叔戊酸（200 μg/L）作為酸類物質檢測內標，根據內標峰圖對所測樣品微量成分進行半定量分析。

1.3.5 數據處理

根據內標峰圖面積比，分別以丙酸辛酯、薄荷醇、叔戊酸標品量對氣質數據進行半定量分析，獲得各微量成分含量。將各組分數值減去對照數值后，利用Heml軟件進行熱圖處理。

2 結果與分析

2.1 酒醅產香酵母分離鑒定

從牛欄山酒醅中獲得120株酵母菌，通過對其26SrDNA D1/D2區進行PCR測序分析，共獲得9株酵母菌，分別標記為菌株NLS-1～NLS-9。系統發育樹采用Mega5.1軟件的Kimura 2-parameter model模型，鄰接法自舉1 000構建而成[15-16]，結果見圖1。

圖1 9株酵母菌基于26S rDNA的D1/D2序列構建的發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 9 yeasts based on 26S rDNA D1/D2 sequences

由圖1可知，從牛欄山酒醅中共分離鑒定獲得9株酵母菌，分別為發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、庫德里阿茲氏畢赤酵母（P.kudriavzevii）、膜醭畢赤酵母（P.membranifaciens）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）、尼泊爾德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis）、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、矮小哈薩克斯坦酵母（Kazachstania humilis）和瑟氏哈薩克斯坦酵母（K.servazzii），其中畢赤酵母屬種類較多，共獲得3種不同畢赤酵母，同時也獲得2種哈薩克斯坦酵母，而異常威克漢姆酵母、尼泊爾德巴利酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母、釀酒酵母各為一種。

2.2 酵母菌高粱發酵培養基風味物質的分析

將所獲得的9株酵母菌純化后通過液體富集培養后，加入高粱發酵培養基中，模擬發酵5 d后，利用酒精混勻進行串蒸。9株酵母菌經過模擬發酵蒸餾后，測定了蒸餾液中風味成分，測定結果見表2。

表2 篩選酵母菌高粱培養基風味物質檢測結果Table2 Determination results of flavor substances of screening yeasts in sorghum medium mg/L

續表

由表2可知，在牛欄山二鍋頭酒中，酯類是重要呈香物質，大部分表現為水果香、花香[17]，乙酸乙酯和乳酸乙酯更是二鍋頭酒中的主要呈香呈味物質，P.kudriavzevii發酵蒸餾液中乙酸乙酯含量能夠達到969.0 mg/L，W.anomalus發酵蒸餾液中含量能夠達到541.4 mg/L，而K.servazzii和K.humilis發酵蒸餾液中乙酯含量僅為28.4mg/L和29.7mg/L，說明同種酵母菌產乙酸乙酯能力相差較大。

醇類物質是牛欄山二鍋頭酒體香氣的重要組成部分，其往往能夠賦予酒體醇香、水果香。在酵母發酵蒸餾液中，共檢測出6種醇類物質，含量較高的主要為正丙醇、異丁醇、異戊醇3類高級醇。高級醇是白酒中的重要呈香呈味成分之一，如果白酒中主要高級醇含量過少，會缺乏傳統白酒的風味，含量過多，不僅會導致酒苦澀、辣味還會出現頭痛、易醉等現象[18]。整體看來，9種蒸餾液中正丙醇、異丁醇、異戊醇含量均高于對照組，但含量上存在不同差異：如正丙醇，對照組含量為34.5 mg/L，K.humilis和S.cerevisiae發酵蒸餾液含量為58.2 mg/L和56.9 mg/L，與對照相比分別增長了68.7%和64.9%，而P.membranifaciens和P.manshurica發酵蒸餾液正丙醇含量僅稍高于對照組；對照樣品中異丁醇含量較低僅為1.2mg/L，P.kudriavzevii發酵蒸餾液中增長較多，達到了89.3 mg/L，P.membranifaciens和P.manshurica含量分別為2.1mg/L、1.8mg/L；異戊醇與異丁醇結果較為相似，同樣是對照組中含量較低1.5mg/L，蒸餾液中S.cerevisiae和P.kudriavzevii大量增長。

醛類物質對白酒呈香起著輔助作用，成品酒中的醛類物質可在貯存過程中通過氧化縮合、自然揮發而使自身含量降低，酒質也隨之逐漸變得綿柔，但過量則使白酒有強烈的刺激感和辛辣味[12]。9種酵母蒸餾液中變化較為明顯的醛類為乙醛，D.nepalensis發酵產乙醛能力最高，能夠產生58 mg/L的乙醛，其次為S.cerevisiae25.8 mg/L、T.delbrueckii 22.7 mg/L和K.servazzii22.0 mg/L。

2.3 酵母菌酒醅發酵風味物質分析

將富集培養后的9種酵母菌加入酒醅培養基中，以空白酒醅發酵培養基作為對照，28℃模擬發酵8 d后，酒精萃取后進行揮發物質氣質聯用半定量分析。

2.3.1 酯類物質分析

以丙酸辛酯為內標，對不同酵母酯類揮發性產物進行半定量分析，結果見表3。

表3 篩選酵母菌酒醅培養基酯類物質含量檢測結果Table3 Determination results of esters contents of screening yeasts in fermented grains medium μg/L

續表

由表3可知，9株酵母菌代謝產物中共檢測到24種酯類物質，如乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯和亞油酸乙酯等，說明9種酵母菌能夠以酒醅作為底物生成多種酯類物質，酯類中的大多數具有水果樣芳香，同時也是構成二鍋頭白酒香味的主要成分。將不同酵母酯類物質扣除對照含量后進行含量熱圖分析，初步獲得不同酵母產酯能力，結果見圖2。

由表3及圖2可知，9株酵母菌利用酒醅中底物能夠合成24種酯類物質，但多數酯類產量較低，辛酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸苯乙酯這幾種酯類物質在多數酵母菌產物中含量稍高，同時發現某些酵母菌能夠生成較高的酯類物質，如W.anomalus（NLS-6）和P.kudriavzevii（NLS-8）具有較強的產乙酸乙酯能力，分別為4 494.27 μg/L、546.21 μg/L，同時也能夠生成乙酸-3甲基丁酯；S.cerevisiae（NLS-3）具有較高的產9-十六烯酸乙酯的能力；W.anomalus（NLS-6）、P.fermentans（NLS-7）和P.membranifaciens（NLS-9）庚酸-3-甲基丁酯合成較高。

圖2 篩選酵母菌酒醅培養基酯類含量熱圖分析Fig.2 Heat map analysis of esters contents of screening yeasts in fermented grains medium

2.3.2 醇、醛及酚類物質分析

以薄荷醇為內標，對不同酵母菌醇類、醛類、酚類物質進行半定量分析，結果見表4。

表4 篩選酵母菌酒醅培養基醇、醛、酚類物質含量檢測結果Table4 Determination results of alcohols,aldehydes and phenolics substances contents of screening yeasts in fermented grains medium μg/L

續表

由表4可知，在9種酵母菌中共檢測到9種醇、2種酮、2種醛、2種酚類及1種呋喃類風味物質，醇類在二鍋頭酒中占有重要地位，它是酒中醇甜和助香的主要物質，同時也是酒中香味成分的前驅物質，可與酸形成酯類物質。醛酮及酚類和呋喃類物質，雖然含量較低，但每種都有各自的香氣和口味，也是白酒香味成分之一。將表4中風味扣除對照樣品含量后進行含量熱圖分析，結果如圖3所示。

圖3 篩選酵母菌酒醅培養基醇、醛、酚類物質含量熱圖分析Fig.3 Heat map analysis of alcohols,aldehydes and phenolics substances contents of screening yeasts in fermented grains medium

由圖3可知，在9種醇類物質中，生成量較為突出的為2-甲基丙醇（異丁醇）、3-甲基丁醇（異戊醇）和苯乙醇，其中T.delbrueckii（NLS-4）、P.kudriavzevii（NLS-8）生成異丁醇、異戊醇能力較強，這與單菌定量分析結果存在一定不同，說明在以酒醅作為底物的培養條件下，不同酵母菌所代謝的產物與純培養存在差異；9種酵母菌中，S.cerevisiae（NLS-3）、T.delbrueckii（NLS-4）和P.kudriavzevii（NLS-8）具有較強的合成苯乙醇的能力，苯乙醇作為芳香族化合物，具有較強的呈香作用，有著令人身心愉悅的花香和水果香，其含量在百分之一、甚至千分之一時就能使人感到強烈的香味[19]；在醛、酮、酚物質中，T.delbrueckii（NLS-4）具有較高的合成苯甲醛的能力（263.6 μg/L）。

2.3.3 酸類物質定性分析

以叔戊酸為內標，對9種酵母菌酸類物質進行半定量分析，結果如表5所示。

由表5可知，本實驗所檢測酸類物質種類較少，9種酵母菌中共檢測到5種酸類物質，分別為乙酸、2-甲基丙酸、丁酸、辛酸和9-十六稀酸，不同有機酸在香氣和味覺上均有差異，但都是二鍋頭酒中重要的呈香物質及酯類合成的前體。將表5中風味扣除對照樣品含量后進行含量熱圖分析，結果如圖4所示。

表5 篩選酵母菌酒醅培養基酸類物質含量檢測結果Table5 Determination results of acids content of screening yeasts in fermented grains medium μg/L

圖4 篩選酵母菌酒醅培養基酸類物質含量熱圖分析Fig.4 Heat map analysis of acids content of screening yeasts in fermented grains medium

由圖4可知，9種酵母菌代謝酸類產物中，生成量較高的是乙酸和辛酸，其中K.humilis（NLS-2）和P.membranifaciens（NLS-9）具有較強的產乙酸能力，P.fermentans（NLS-7）具有較高的產辛酸能力。在白酒眾多有機酸中，乙酸具有爽口帶甜等特點，辛酸雖然具有脂肪臭，呈刺激感，但這些酸類在白酒味道調節中起重要作用[20]。

3 結論

本研究從牛欄山二鍋頭釀造酒醅中共分離獲得9株酵母菌，在高粱培養基中，庫德里阿茲氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）乙酸乙酯產量較高，分別為969.0 mg/L和541.4 mg/L，9種蒸餾液中正丙醇、異丁醇、異戊醇含量均高于對照組，尼泊爾德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis）發酵產乙醛能力最高（58mg/L）；在酒醅培養基中，9株酵母菌代謝產物中共檢測到25種酯、9種醇、5種酸、2種酮、2種醛、2種酚及1種呋喃，其中W.anomalus產乙酸乙酯能力最強4 494.27 μg/L，P.kudriavzevii具有較強的產乙酸乙酯、苯乙醇、異丁醇及異戊醇能力，分別為546.21 μg/L、724.96 μg/L、31.56 μg/L及142.52 μg/L，膜醭畢赤酵母（P.membranifaciens）產乙酸能力最強（498.56 μg/L）。通過兩種方法的篩查分析，可以初步獲得不同酵母菌在不同條件下生成揮發性風味的能力，這將有助于解析發酵過程中不同酵母菌的作用，更加系統的了解白酒的產香機理，同時也為今后的基酒釀造提供一定的基礎信息。