紅提葡萄中酵母菌多樣性的研究

徐建坤，張 旺，肖 婧，程衛東，史學偉*

（1.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學 信息科學與技術學院，新疆 石河子 832000）

紅提葡萄果實大而飽滿、甜度高、營養豐富、果皮略厚、不易脫粒[1]，營養十分豐富[2]，因而自釀葡萄酒備受人們歡迎[3]。酵母菌主要在無氧條件下進行繁殖，在有氧條件下將糖發酵成酒精和二氧化碳，是一種典型的兼性厭氧微生物，遍布于整個自然界[4-5]。在葡萄酒釀造過程中，酵母菌不僅是發酵劑，而且會影響葡萄酒的品質、產量以及香氣等[6-7]。由于與葡萄酒中的花青素發生反應，酵母產生的β-D-糖苷酶和酵母代謝產物丙酮酸、乙醛導致酒體中單體花青素降解，從而改變葡萄酒的顏色特征[7]。不同品種、地區葡萄自身所帶酵母菌的不同，不同酵母菌發酵所產生的發酵產物的不同，以及釀造過程的發酵工藝及發酵環境的不同等諸多因素的影響下使得由天然酵母進行發酵所釀造的葡萄酒具有較為獨特的地方特色[8-9]。在酒精發酵中，酵母菌是主力軍，但不是所有的酵母菌都是有利于葡萄酒發酵的進行的，因此，研究酵母菌的多樣性也是有助于避免敗壞性酵母的識別[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅提葡萄：從新疆石河子地區采摘。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、乙醇、檸檬酸、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、硫酸銨、硝酸鉀、尿素、氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、酵母膏、酵母菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒、溶壁酶、2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、ddH2O、Ladder Marker、DNA擴增引物（ITS）：上海生工生物技術有限公司。以上試劑均為分析純或生化試劑。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextros，YEPD）培養基、WL瓊脂培養基、同化碳源基礎培養基、同化碳源液體培養基、同化氮源基礎培養基、同化氮源液體培養基：上海生工生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-250B生化培養箱：常州諾基儀器有限公司；DYY-8C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；T100PCR儀、GelDOC XR凝膠成像系統：美國BioRad公司；CX21FS1光學顯微鏡：日本Olympus公司；LAC-5040S全自動高壓滅菌鍋：浙江新豐醫療器械有限公司；SW-CJ超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；Bnp-9272智能生化培養箱：上海精宏試驗設備有限公司；B250恒溫水浴鍋：上海予卓儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

紅提葡萄中酵母菌的分離：取10顆紅提葡萄經破碎后放于裝有100 mL YEPD液體培養基（提前滅菌）的250 mL錐形瓶中并搖勻。28℃搖床培養24 h，搖床轉速設定為180 r/min，富集培養結束后去5 mL培養液作為菌株分離的樣品。

1.3.2 菌株的分離純化

用1mL移液槍吸取1 mL培養液于9 mL無菌水試管中，振蕩混勻，標記為10-1稀釋度，用1 mL移液槍吸取1 mL 10-1稀釋度的培養液于9 mL無菌水試管中，標記為10-2稀釋度，依次稀釋7個梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），用200 μL移液槍吸取200 μL菌液于YEPD固體培養基的平板上進行涂布，每個稀釋梯度平行涂布3個平板，28℃恒溫培養箱培養24 h。挑取YEPD固體培養基中不同形態、不同大小的菌落在YEPD固體培養基上進行劃線，在28℃恒溫培養箱中培養24 h，經多次劃線純化得到單一菌落。

1.3.3 WL培養基表型鑒定及菌株形態觀察

根據培養基上菌落的大小、顏色、光澤、形狀等表型的差異，對供試菌株進行初步分類并且挑選出代表菌株，使用光學顯微鏡進行顯微形態觀察，采集顯微觀察照片。

將分離菌株劃線接種于WL培養基上，28℃恒溫培養箱培養24 h，觀察菌落形態及顏色，根據菌落形態及顏色對所分離酵母菌進行初步分類。

1.3.4 生理生化試驗

分離酵母菌的生理生化試驗主要包括：糖發酵試驗、氮源同化試驗以及碳源同化試驗[12]。

（1）酵母菌的糖發酵試驗：將各種種類的糖（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖）加入0.6%的酵母浸粉溶液中，使糖含量達到2%，然后將配制好的溶液分別加入含有杜氏發酵管的試管中，接入活化的供試菌株，28℃恒溫培養箱培養48 h。在培養過程中，若杜氏管頂部出現氣泡，則說明供試菌株可以利用此種糖，此時可記為“+”（陽性反應），若無變化，記為“-”（陰性反應）。

（2）氮源同化試驗：將處于生長期的供試菌株接入氮源液體培養基中，于28℃恒溫培養箱培養48 h，觀察生長情況和溶液變化情況，并與空白試驗對照，觀察溶液是否發生渾濁，是否形成環島和菌璞等。

（3）碳源同化試驗：將處于生長期的供試菌株接入碳源液體培養基中，于28℃恒溫培養箱培養48 h，觀察生長情況和溶液變化情況，并與空白試驗對照，觀察溶液是否發生渾濁，是否形成環島和菌璞等。

1.3.5 菌種的保藏

在酵母菌劃線平板中挑取單菌落于裝有10 mL YEPD液體培養基的試管中，在28℃恒溫培養箱中培養24 h。用1 mL移液槍吸取0.75 mL經滅菌體積分數為甘油于1.5 mL離心管中，冷藏備用。將培養菌液與60%的滅菌甘油1∶1混合，-70℃保藏。

1.3.6 DNA的提取

通過離心收集菌體后按照BioFlux真菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量，提取的DNA放置在-20℃環境中保存，以避免DNA降解。

1.3.7 PCR擴增

使用上述方法提取的酵母菌DNA樣品2 μL為擴增模板，引物ITS12μL，引物ITS42μL，ddH2O19μL，Mix25μL，空白不加樣品，ddH2O21μL。擴增使用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR擴增程序：94℃變性1 min，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36個循環[13]。

1.3.8 PCR反應產物的電泳檢測

將3μLPCR產物點樣到1%瓊脂糖凝膠（已加入染色液）的點樣孔中，電壓110V，電流90mA，時間約30min。用凝膠成像儀觀察電泳結果，將合格的PCR反應產物送檢。

1.3.9 PCR產物測序和系統發育分析

將電泳檢測合格的PCR擴增產物送至華大基因進行測序。測序完成后將測序基因進行拼接，然后使用美國國立生物信息技術中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中的BLAST進行測序菌株的同源性比對，獲得同源酵母標準菌株的序列后，使用ClustalW程序將菌株序列進行匹配排列，然后結合軟件Mega 6.0構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離、純化及在WL培養基上的形態分類[14-15]

通過YEPD液體培養基的富集及YEPD固體培養基的分離和純化，一共從紅提葡萄中分離純化和保藏得到24個酵母菌菌株，編號為Y-1～Y-24。

由表1可知，通過對酵母菌在WL培養基菌落形態的觀察，初步判斷菌株Y-4、Y-13、Y-21、Y-24為同一屬，菌株Y-2、Y-3、Y-6、Y-19為同一屬，其他菌株還不能判斷。

觀察24株酵母菌分離株菌落形態，菌落形態幾乎為圓形或橢圓形；顏色大多為白色或者淡黃色，個別菌落為淡紅色。通過對分離得到的24株酵母菌進行形態觀察，并對這些菌株進行初步的分類和歸納，24株酵母菌大概分為3個類別，其菌落形態及個體形態如圖1所示。

表1 酵母菌在WL培養基上的菌落形態Table1 Morphology of yeasts on WL medium

圖1 酵母菌菌落形態（A）和個體形態（B）Fig.1 Colonial morphology(A)and individual morphology(B)of yeasts

2.2 生理生化分析

2.2.1 糖發酵試驗

由表2可以看出，24株酵母菌均可以利用葡萄糖進行發酵，都不可以利用蔗糖、麥芽糖和乳糖進行發酵。

表2 24株酵母菌糖發酵試驗結果Table2 Results of sugar fermentation tests of 24 yeasts

2.2.2 氮源同化試驗

表3 24株酵母菌氮源同化試驗結果Table3 Results of nitrogen source assimilation tests of 24 yeasts

續表

由表3可知，所有菌株都不可同化尿素和硝酸鉀，都可同化硫酸銨。

2.2.3 碳源同化試驗

表4 24株酵母菌碳源同化試驗結果Table4 Results of carbon source assimilation tests of 24 yeasts

由表4可知，除了菌株Y-2、Y-3、Y-6、Y-19可同化蔗糖，其余菌株都不可同化蔗糖。其他菌株都能夠同化乙醇和檸檬酸為碳源。所有的菌株都不能同化可溶性淀粉。

結合表1～3可以看出，菌株Y-1、Y-5、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-14、Y-15、Y-16、Y-17、Y-18、Y-22均可發酵葡萄糖，不可發酵蔗糖、乳糖與麥芽糖；在氮源同化試驗中均可同化硫酸銨，不可同化硝酸銨和尿素；在碳源同化試驗中都可同化乙醇和檸檬酸，不可同化蔗糖和可溶性淀粉；可初步判斷為畢赤酵母屬。其余菌株目前不能判斷。

2.3 分子生物學鑒定

2.3.1 酵母菌PCR擴增結果

將提取的酵母菌DNA進行PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，在500～600 bp出現了特異性擴增條帶，且條帶較為明亮，在酵母菌的理論預期值之內，PCR擴增結果符合測序標準，可進行測序。電泳檢測結果如圖2所示。

圖2 26S rDNA D1/D2區域PCR擴增產物凝膠電泳結果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products for 26S rDNA D1/D2 region

2.3.2 酵母菌DNA測序比對結果

本試驗分離出的24株酵母菌測序結果使用NCBI數據庫的Blast程序調用Genbank數據庫進行同源性比對，選擇同源性最高的菌株，比對結果如表5所示。

表5 24株酵母菌同源性比較及登錄號Table5 Homology comparison and registration numbers of 24 yeasts

續表

2.3.3 系統發育樹的建立

圖3 紅提葡萄酵母ITS序列區系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of ITS sequence region of yeast from red grape

由圖3可知，菌株Y-1、Y-5、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-14、Y-15、Y-16、Y-17、Y-18、Y-20、Y-22、Y-23的ITS區序列在進化關系上親緣關系較近，在系統發育樹上形成了第一類群，屬于畢赤酵母屬（Pichia）。菌株Y-2、Y-3、Y-6、Y-19的ITS區序列在進化關系上親緣關系較近，在系統發育樹上形成了第二類群，屬于梅奇酵母屬（Metschnikowia）。菌株Y-4、Y-13、Y-21、Y-24的ITS區序列與漢遜酵母屬（Hanseniaspora）在進化關系上親緣關系較近，形成第三類群。

結合圖3和表5可得，畢赤酵母屬占所有酵母菌的66.67%，分離所得24株酵母菌中有12株為庫德畢赤酵母，占比為50%，其次是葡萄汁有孢漢遜酵母和梅奇酵母，占比都是16.67%。所有分離株與相對應的參考菌株同源性都達到了98%以上，并與其聚在一起，證明酵母菌ITS區域序列分析結果的準確性[16-20]。分離酵母菌株基因鑒定結果與表型鑒定結果、生理生化試驗鑒定結果基本一致。

3 討論

紅提葡萄是一種鮮食葡萄，它的含糖量在17%左右，相較于釀酒葡萄的含糖量較低，這與釀造優質葡萄酒的條件有著天然的差距，也因此人們對于其酵母菌多樣性的研究較少。賈春鳳等[2]主要研究了紅提葡萄在發酵過程中的酵母菌及其耐受性和發酵能力，篩選出了具有較好耐受性的菌株。黃靜等[26]研究了鮮食葡萄紅提和戶太八號的釀酒特性，對總酚、單體酚和花色苷在不同貯藏條件下的變化情況進行了詳細闡述；而都晗等[27]則將鮮食葡萄戶太八號、夏黑和釀酒葡萄愛格麗、嘉年華、玫瑰香進行起泡葡萄酒的釀造，得出愛格麗及夏黑釀造的起泡葡萄酒品質較高。這說明在葡萄酒的釀造中，鮮食葡萄也有自己的可取之處。

而本研究沿著前人的思路進一步將分離所得的酵母菌進行分離鑒定，并構建發育樹來闡述紅提葡萄中酵母菌的多樣性，從而發掘紅提葡萄所蘊含的酵母菌資源。

另一方面，發酵過程中的酵母菌除了添加的人工酵母和葡萄所攜帶的野生酵母還可以來自酒廠機械環境，發酵酵母的多樣可以使葡萄酒的風味多樣[21-24]，因此進行酵母菌多樣化的研究是有重要意義的。

今后開展紅提葡萄酵母菌多樣性的研究可從紅提葡萄園的土壤中分離本土化酵母菌群也可選取不同地區的紅提葡萄分離酵母菌群，并對其中參與葡萄酒釀造的酵母菌進行深入研究，從而選育具有地區特色的酵母菌，為我國葡萄酒釀造產業服務，為紅提葡萄表皮酵母菌資源的開發與利用服務。

4 結論

通過對石河子紅提葡萄酵母菌的篩選、純化、提取DNA，對提取的DNA進行PCR擴增，將擴增的PCR產物送檢利用分子生物學鑒定，結合表型鑒定得到24株酵母菌，最終被鑒定為3個屬，分別為漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤酵母屬（Pichia）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）。5個不同種群，分別為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）、梅奇酵母（Metschnikowia）。并且庫德畢赤酵母為優勢酵母菌群。