狐尾藻乙酸乙酯萃取部位總黃酮含量測定與抗氧化活性研究

陳春雅，毛玉玲，李澤寧，許益迪，潘奇獻，徐潤生

（浙江農林大學暨陽學院，浙江 紹興 311800）

0 前言

藻類是一種非常重要的植物資源。分布廣泛，成本低廉。不僅可以改善環境，而且廣泛應用于醫藥、功能材料、合成工業等領域[1]。已有文獻報道目前用于食用的淡水藻類幾乎都具有一定的藥用價值。從藻類植物中提取的黃酮類物質又稱生物類黃酮，泛指兩個苯環（A-環和B-環）通過中央三碳鍵相互連接而成的一系列C6-C3-C6化合物。主要是指以2-苯基色原酮為母核的化合物。天然的生物類黃酮多為其基本結構的衍生物，多以糖苷形式存在。有防血栓、保護心腦血管作用，抗腫瘤、消炎抑菌；解除醇中毒、保肝護肝；清熱解毒、祛風濕、強筋骨；調節免疫力等作用[2]。藻類資源的開發利用具有前瞻性的意義。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

本次研究所用試劑均為分析純。

儀器：UV-2000紫外可見分光光度，AL104電子天平。

1.2 提取與濃縮

取干燥狐尾藻340 g，剪碎，用95%的乙醇提取三次，料液比為1∶9。將提取液進行減壓抽濾。通過真空減壓濃縮裝置，在旋轉蒸發儀上旋轉蒸發得到8.2 g的墨綠色的浸膏。

浸膏在超聲波作用下分散到適量的水中，用沸程60℃～90℃石油醚進行反復萃取，到石油醚層溶液顏色近為無色為止。合并石油醚萃取液，濃縮后得石油醚部位。

石油醚萃取后的水相用乙酸乙酯萃取，有機萃取液與水相體積比為3∶1，至乙酸乙酯層溶液顏色近為無色為止。合并乙酸乙酯萃取液，濃縮后得乙酸乙酯部位浸膏6.2 g。

1.3 分離

乙酸乙酯萃取部位，旋蒸成干粉。進行硅膠（200～300目）柱色譜分離，采用濕法裝柱。以石油醚、乙酸乙酯按極性遞增進行梯度洗脫。每100 mL收集一份，通過TLC檢識，合并相同流分。

1.4 總黃酮定性鑒別

通過鹽酸鎂粉反應定性檢測是否含有黃酮類化合物，采用1-萘酚試劑檢測是否含有黃酮苷。觀察樣品溶液變色情況，觀察1-萘酚反應結果是否為陽性。

1.5 總黃酮含量測定

本次實驗總黃酮含量的測定采用Al（NO3）3-Na（NO）-NaOH比色法，在510 nm處進行吸光度值測定。此法利用顯色反應可避開其他成分的干擾。以蘆丁作對照品通過標準曲線的繪制測得總黃酮含量。

（1）精密稱取0.0017 g蘆丁對照品，用70%的乙醇將其進行溶解，并且使用10 mL容量瓶對其進行定容，配制成為0.17 mg·mL-1濃度的對照品溶液。

（2）精密吸取蘆丁標準溶液 0 mL、0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL 于 10 mL 容量瓶中，分別加入5 mL的70%乙醇溶液，再加入1 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min，然后加入 1 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置6 min，最后加入3 mL的4%氫氧化鈉溶液，用70%乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置15 min。把沒有添加任何標準液的試管作為空白對照，依照上述方法進行配置，取潔凈的比色皿將上述試液倒入，并且在510 nm波長處測定其吸光度值。以吸光度值A為縱坐標，以對照品溶液濃度c（mg·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線。

（3）取黃酮類化合物浸膏，用電子天平稱取2.000 g，再分別用70%的乙醇浸泡在錐形瓶內，并吸取一定量的樣品溶液于10 ml錐形瓶中，按上述方法于510 nm處測定樣品吸光度值重復三次，按標準曲線的回歸方程計算出各個樣品的總黃酮含量取平均值。總黃酮含量用蘆丁當量RE（Rutin equivalent）表示。

1.6 抗氧化活性的測定

1.6.1 清除DPPH自由基能力的測定

圖1 蘆丁標準曲線

稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.004 mg/mL的DPPH溶液。分別取2 mL不同濃度的樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，5000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測吸光值。用Ve作為陽性對照。

1.6.2 測定活性物質對羥自由基的清除率

采用Fenton試劑[3]：過氧化氫/亞鐵鹽。H2O2與亞鐵離子反應生成·OH自由基一般存活時間比較短，具有較高的反應活性。當在反應體系中添加水楊酸，便能快速地捕捉·OH而產生紫色化合物（2，3-二羥基苯甲酸，該有色化合物在510 nm處有較大吸收峰，測其吸光度可表示羥自由基（·OH）的多少，吸光度與羥白由基（·OH）的量成正比。反應體系中若加入羥自由基（·OH）清除劑后，被氧化的水楊酸減少則體系顏色變淺甚至消失，吸光度變小。

2 結果與討論

2.1 總黃酮定性鑒別結果

通過鹽酸-鎂粉定性實驗發現樣品溶液即刻變成橙紅色，α-1萘酚實驗結果顯示為陽性，說明有樣品中含有黃酮類化合物。

2.2 總黃酮含量測定結果

按照樣品總黃酮含量測定方法對樣品吸光度值進行測定，記錄數值。

含量計算方程如下所示：

測試結果如表1。

表1 總黃酮含量

由上述數據可知狐尾藻乙酸乙酯部位總黃酮含量較高，具有很好的開發價值。目前的研究認為紫外輻射、高光強、低溫、干旱、營養缺乏、高濃度CO2等因素均可能促進黃酮的合成[4]，通過進一步實驗，獲得黃酮含量較高的狐尾藻具有十分重要的意義。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH抗氧化活性分析

DPPH自由基在517 nm波長附近有最大吸收峰，當 DPPH自由基與抗氧化劑反應后，517 nm波長處的吸收值 降低，其降低的程度與接收的電子（抗氧化劑清除自由基活性）呈定量關系，反應進程很容易通過分光光度計監測。DPPH自由基清除計算公式一般為：

計算結果如表2所示。

表2 DPPH清除率

由表2數據可知，在一定濃度范圍時（0.01～0.2 mg/mL），樣品顯示出比對照品Ve更好的抗氧化效果。

2.3.2 羥基自由基抗氧化活性分析

羥基自由基清除率所用公式如下：

表3 樣品清除·OH自由基效果

由以上數據可知：濃度在0～0.2 mg/mL時，樣品具有較好的清除效果，即具有較好的抗氧化活性。

2.4 討論

狐尾藻乙酸乙酯部位中具有較高的總黃酮含量，在DPPH抗氧化活性分析及羥基自由基抗氧化活性分析結果中均體現出良好的清除自由基能力，即良好的抗氧化效果。

許多重要生命現象和疾病都與自由基有著直接或間接關系[5]。狐尾藻作為一種資源豐富，繁殖力強的植物，在治理污水、改善水域環境等方面具有良好的作用，而從另一個角度觀察，其本身所具有的開發價值遠遠不止如此，它所蘊含的有機物潛力是巨大的，對其開發利用在多種領域具有十分重要的意義。我們不僅發現和拓寬了它的市場價值，也為以后的科學研究提供基礎。