[Ru（bpy）2dppz]2+的合成及其與DNA的相互作用研究

梁霞霞，周 兵，黃榮富

（成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，四川 成都 610059）

0 前言

釕配合物是具有豐富的光化學(xué)、光物理和電化學(xué)等性質(zhì)，因此，可用作DNA的結(jié)構(gòu)探針。例如，Δ-Ru （phen）32+作為 B-DNA 結(jié)構(gòu)探針， 用于DNA 結(jié)構(gòu)的研究[1]；此外，[Ru（bpy）2dppz]2+和[Ru（phen）2dppz]2+，因具有剛性、共平面的電子共軛體系，與DNA結(jié)合力強(qiáng)，能插入DNA堿基對(duì)之間[2-4]。同時(shí)，[Ru（bpy）2dppz]2+及其衍生配合物作為核酸探針還具有無毒、性質(zhì)穩(wěn)定、靈敏度高、選擇性好、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。在金屬抗癌藥物方面，[Ru（bpy）2dppz]2+及其衍生物具有較高的抗腫瘤活性，并將其大量用于臨床研究之中[5-7]。熒光光譜是一種光致發(fā)光方法，是研究小分子與DNA之間作用方式的方法之一，它是一種比較靈敏的分析方法。 本文通過兩步反應(yīng)合成了[Ru（bpy）2dppz]2+，并分別用紫外-可見吸收光譜法、核磁共振和質(zhì)譜對(duì)Ru-dppz進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，利用熒光法考察了Ru-dppz與雙鏈DNA（dsDNA）的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

F-4600熒光光譜儀（日立），UV-2700紫外分光光度計(jì) （日本島津公司），LC/MSD-VL液質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫公司）；鄰苯二胺、1，10-鄰菲羅啉-5，6-二酮、二水合順-雙（2，2’-二吡啶基）二氯化釕（[Ru（bpy）2]Cl2·2H2O）（購(gòu)自上海阿拉丁）、小牛胸腺DNA（Calbiochem，德國(guó)）、其它化學(xué)試劑均購(gòu)自于成都科隆化學(xué)試劑公司。所有試劑均屬分析純無需進(jìn)一步純化。

1.2 Ru-dppz的合成

分別稱取0.4997 g鄰苯二胺、0.4998 g 1，10-鄰菲羅啉-5，6-二酮置于燒杯中，加入適量乙醇（約30 mL）微熱使其完全溶解，將鄰苯二胺溶液緩慢加入到 1，10-鄰菲羅啉-5，6-二酮溶液中，邊加入邊攪拌，然后在溫水浴中加熱至沸騰，保持沸騰5 min；在冰水浴中冷卻結(jié)晶（紅棕色），過濾后再重結(jié)晶得到棕黃色針狀產(chǎn)物（Dppz）。

稱取0.4852 g順-雙（2，2'-二吡啶基）二氯化釕 （II）與上步制備的配體0.2913 g于250 mL錐形瓶中，加入120 mL甲醇和水的混合溶劑（V水∶V甲醇=2∶1）溶解。在恒溫磁力攪拌器上恒溫加熱并攪拌回流4.5 h，得到深紅色溶液，保持恒溫蒸發(fā)至15 mL，加入45 mL蒸餾水，繼續(xù)煮沸10 min。將溶液在冰水浴中冷卻沉淀，過濾沉淀。在濾液中加入10 mL 10%的氟硼酸鈉溶液以沉淀合成的[Ru（bpy）2dppz]2+，過濾得到紅棕色粗產(chǎn)物[Ru（bpy）2dppz]（BF4）2沉淀。 將所合成的粗產(chǎn)物于30 mL 80%的乙醇中微熱溶解，并于水浴中冷卻結(jié)晶，過濾得深紅色粉末狀沉淀，以此方法再次重結(jié)晶以提純產(chǎn)物而獲得終產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ru-dppz的合成

Ru-dppz的合成可以通過兩步反應(yīng)制得：首先，1，10-鄰菲羅啉-5，6-二酮與鄰苯二胺反應(yīng)制備聯(lián)吡啶體配合物二吡啶[3，2-a；2'，3'-c]吩嗪（Dppz）；第一步的產(chǎn)物 Dppz再與順-雙（2，2'-二吡啶基）二氯化釕（II）二水合物（Ru （bpy）2Cl2）反應(yīng)制備二聯(lián)吡啶二吡啶[3，2-a；2'，3'-c]吩嗪釕（Ru-dppz）。反應(yīng)方程式如圖1所示。

圖1 Ru-dppz的合成途徑

2.2 Ru-dppz的核磁共振譜（NMR）

首先，將所合成的產(chǎn)物使用核磁共振進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示：δ=8.033～8.313的兩組多重峰為 （2，7，10，11，12，13 位質(zhì)子峰），δ=9.284～9.300 的二重峰為（1，8 位質(zhì)子峰），δ=9.758～9.778的二重峰為 （3，6 位質(zhì)子峰），δH（CD3CN），7.28（2H，td，J=1.2，6.4 Hz），7.49（2H，td，J=1.2，6.0 Hz），7.75（2H，d，J=5.2 Hz），7.88（2H，d，J=4.8 Hz），7.91（2H，dd，J=6.0，8.0 Hz），8.04 （2H，td，J=1.2，7.6～8.4 Hz），8.12～8.20（6H，多重重疊），8.50（2H，dd，J=3.6，6.4 Hz），8.56 （4H，dd，J=8.4，13.2 Hz），9.69（2H，dd，J=1.2，8.4 Hz）。 表征結(jié)果與文獻(xiàn)值一致[8-10]。

2.3 Ru-dppz的紫外-可見吸收光譜圖

我們研究了Ru-dppz的紫外-可見吸收光譜，如圖（3）所示，Ru-dppz在 281 nm、368 nm、440 nm分別出現(xiàn)3個(gè)吸收峰，與所參考文獻(xiàn)紫外吸收譜圖的吸收峰一致[11]。

圖2 Ru-dppz核磁共振氫譜圖（溶劑為CD3CN）

此外，我們還利用質(zhì)譜測(cè)得Ru-dppz的質(zhì)荷比（m/z）為 346，與我們理論計(jì)算的[Ru（bpy）2dppz]2+的質(zhì)荷比一致。綜合這三種方法的表征結(jié)果，由Ru-dppz的紫外可見光吸收譜圖中出現(xiàn)的3個(gè)特征吸收峰，核磁共振氫譜圖的解析，以及質(zhì)譜所得其分子量信息，證明成功合成了Ru-dppz。

圖3 Ru-dppz的紫外可見吸收光譜圖

2.4 Ru-dppz的熒光特性研究

2.4.1 Ru-dppz的“光開關(guān)”行為研究

從譜圖（圖4）可知最大發(fā)射波長(zhǎng)在615 nm左右，并且熒光強(qiáng)度隨著dsDNA的濃度增加而增強(qiáng)。根據(jù)熒光性質(zhì)的研究可以得出結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)合成的產(chǎn)物Ru-dppz具有熒“光開關(guān)”分子的性質(zhì)，即單獨(dú)的Ru-dppz熒光信號(hào)很微弱，當(dāng)與ds-DNA相互作用以后產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。

圖4 10 μmol/L 的 Ru-dppz（a）在加入 10 μg/mL（b）和 100 μg/mL（c）的 dsDNA 前后的熒光光譜圖（激發(fā)波長(zhǎng)：460 nm）

2.4.2 Ru-dppz與dsDNA的相互作用研究

圖5是Ru-dppz與dsDNA的熒光滴定曲線。從圖5可以看出，初始階段熒光強(qiáng)度隨著Rudppz濃度的增加而增加，最后趨于飽和達(dá)到平臺(tái)。以熒光強(qiáng)度增加部分?jǐn)M合一條直線，其斜率為K1=2.8461×108。將拐點(diǎn)處的點(diǎn)分別計(jì)算binding值，b=信號(hào)/K1，在分別用該拐點(diǎn)Ru-dppz的實(shí)際濃度減去binding值，以Free表示。然后以b對(duì)b/Free作直線，可以得到一條斜率K2=-6.7953×10-8的直線L2，對(duì)K2求負(fù)倒數(shù)即為Ru-dppz的結(jié)合常數(shù)。帶入斜率K2，計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)K=1.5×107L/mol。

圖5 不同濃度Ru-dppz與 dsDNA（5.1 μg/mL）相互作用后的熒光譜圖（a至m濃度依次為0.430、0.644、0.854、1.064、1.274、1.484、1.694、1.904、2.114、2.324、2.639、3.164、3.689 μmol/L）激發(fā)波長(zhǎng)：460 nm）。插圖為對(duì)應(yīng)的Ru-dppz的濃度信號(hào)曲線。

由Ru-dppz的濃度曲線圖可以獲得在熒光強(qiáng)度達(dá)平臺(tái)后的平均熒光強(qiáng)度為266.2，直線L1與平臺(tái)的交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度為Ru-dppz與小牛胸腺DNA的最大結(jié)合濃度，即將平臺(tái)信號(hào)266.2帶入L1計(jì)算獲得濃度Cmax=1.09×10-6mol/L。且dsDNA的校正濃度按每個(gè)堿基對(duì)的平均分子量為 325，則換算為堿基的摩爾濃度為C堿基=15.69 μmol/L。則該結(jié)合比 CRu-dppz：C堿基=0.07，染料與堿基對(duì)之比為0.14，即 7.14個(gè)堿基對(duì)結(jié)合1個(gè)Ru-dppz分子。

3 結(jié)論

本文通過兩步反應(yīng)合成了 “光開關(guān)”分子，Ru-dppz，并通過三種不同的方法表征了本物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。產(chǎn)物的紫外-可見吸收光譜、核磁共振氫譜和質(zhì)譜表征結(jié)果與理論結(jié)果一致，說明實(shí)驗(yàn)中成功合成Ru-dppz。Ru-dppz與dsDNA相互作用研究表明，Ru-dppz與dsDNA結(jié)合后，熒光信號(hào)得到恢復(fù)。通過熒光滴定實(shí)驗(yàn)，測(cè)得Ru-dppz與dsDNA的結(jié)合常數(shù)為1.5×107L/mol，染料與堿基對(duì)之間的結(jié)合比為0.14。