抑制miR-210的表達對鼻咽癌放射抵抗細胞敏感性的影響

梅雪霜 胡洪義 田懷谷 陶源 楊煒強 楊媛媛 劉洪宇

(1北京大學深圳醫院鼻喉科，廣東 深圳 518000；2北京大學深圳醫院醫務部)

鼻咽癌(NPC)是發生于鼻咽腔上壁和側壁的高發性惡性腫瘤，居于耳鼻咽喉惡性腫瘤之首〔1〕；我國南方地區及東南亞地區為NPC的高發地帶，且近年來發病率日益增高〔2〕。放射治療作為NPC主要治療手段，其5年存活率為68%，但放射治療腫瘤殘留復發比例高達50%〔3〕，提示部分NPC患者存在著某種放射抵抗機制使其對放射治療的敏感性降低。但目前仍沒有可預測NPC放射治療敏感性的生物學標志物。微小(mi)RNA在不同的疾病發生發展過程中起到了與癌基因或抑癌基因相類似的調控作用。研究表明，miRNA表達水平與腫瘤的增生及其放射敏感性有著密切的聯系，但此類研究多集中于肺癌、結直腸癌、胃癌、肝癌等疾病〔4～7〕，而miRNA對NPC放射治療敏感性影響的研究十分匱乏。本研究旨在探討抑制miR-210的表達對NPC放射抵抗細胞敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1實驗試劑及儀器 RPMI-1640培養液、 Gibco胎牛血清(FBS，上海江林生物科技有限公司)；雙向電泳試劑(美國Boston Scientific公司)；LV-hsa-miR-210-inhibition(美國Bio-Rad公司)；RNA提取試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒miRNA定量試劑盒(美國Gene Copoeia公司)；細胞計數試劑盒(CCK)-8(日本同仁生物科技公司)；Faxitron生物輻照儀(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司)；雙向電泳及分析系統(美國Boston Scientific公司)；凝膠成像分析系統(德國西門子公司)；Triple TOF高分辨質譜儀(美國Medtronic公司)；動物總RNA快速提取試劑盒(離心柱Ⅰ型,上海捷瑞生物工程有限公司)；臺式高速冷凍離心機(美國Bio-Rad公司)。

1.2細胞培養及誘導 CNE-2細胞株(賽百慷生物技術股份有限公司)于10%FBS RPMI1640培養液中，置于5%的CO2、飽和濕度37℃的培養箱中進行常規培養。用X射線按2、4、6、8 Gy梯度劑量照射，每個劑量照射誘導4次，時間間隔為10～15 d，篩選成活的CNE-2R細胞，繼續培養，穩定傳代14 d后進行后續實驗。各項試驗均獨立重復3次。

1.3雙向凝膠電泳(2DE)結合質譜分析法 取CNE-2和CNE-2R細胞1×108個，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入蛋白裂解液，充分正當裂解60 min，臺式離心機1 500 r/min，4℃離心45 min，取上清液與水化液混合，對取得的溶液進行第一向等電聚焦，將膠條表面覆蓋油吸干，經十二烷基硫酸鈉(SDS)-二硫蘇糖醇(DTT)緩沖液平衡后轉移至12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，進行第二向電泳。電泳結束后取出膠條，去離子水沖洗，考馬斯亮藍R-250染色液染色。然后用GE公司的Image Master 2D platinum7.0進行圖像分析，選取CNE-2和CNE-2R細胞蛋白表達差異大于2倍且P<0.05的差異點，進行質譜分析。收集蛋白質差異點并進行PBS漂洗脫色、蛋白酶降解、萃取和液氮冷凍干燥，用基質液溶解后，形成多肽離子進行多肽質量指紋分析，獲得的圖譜用Explore TM分析。

1.4I-210的建立 取生長良好的CNE-2R細胞接種于6孔板，細胞密度為1×105個/ml，放入培養箱中培育，待細胞貼壁后，加入20 μl miR-210抑制慢病毒載體LV-hsa-miR-210-inhibition，用無血清的RPMI1640培養液補足至1 ml，12 h后再次更換RPMI1640培養液，96 h后觀察免疫熒光蛋白(GFP)表達情況，通過4.5 μg/ml嘌呤霉素篩選15 d，取得的細胞為穩定的I-210細胞。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)技術 向CNE-2R和I-210細胞中加入Trizol使其充分裂解，經過反復離心(11 000 r/min，4℃，10 min)裂解后，室內晾干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)-H2O充分溶解提取總RNA。根據miRNA反轉錄試劑盒的說明書操作轉錄出cDNA，-20℃保存，然后根據miRNA定量試劑盒操作流程操作，RT-qPCR檢測CNE-2R和I-210細胞株中miR-210的表達情況。

1.6CCK-8技術 細胞中加入胰蛋白酶消化，然后細胞重懸，制成混懸液，接種于96孔板，密度為5×103個/ml，細胞貼壁后，進行0、2、4、8 Gy濃度梯度的照射，每種梯度照射3次，每次24 h，經過PBS漂洗后10 μl的CCK-8，繼續培養2 h，測定450 nm處吸光度，并計算細胞存活分數(SF)=照射組吸光值/對照組吸光值，繪制生存曲線。

1.7流式細胞技術 向經過6 Gy照射處理的細胞中加入脫乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化，然后細胞重懸、離心，1 000 r/min，5 min，PBS漂洗2次，收集到細胞樣本。冰無水乙醇處理后加入PBS重懸細胞，加入0.25 mg/ml的核糖核酸酶(RNase),37℃下處理30 min。加入500 μl碘化丙淀(PI)染料(50 μg/ml)，室溫下避光染色15 min，流式細胞儀在1 h內檢測細胞周期。用上述方法收集到樣本細胞，用結合緩沖液沖洗，后用Annexin-V試劑盒，4 h內進行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8克隆成體技術 細胞PBS漂洗后加入胰蛋白酶消化，然后細胞重懸，制成懸液，接種于6孔板，調制密度為1×103個/ml，振動板邊，使其分布均勻。待其貼壁后，進行0、4、8、12 Gy的照射，2 w后，經過PBS漂洗，加入4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，收集計數>50個細胞的集落，得到不同劑量下CNE-2R和I-210細胞存活率，以放射劑量為橫坐標、細胞存活率為縱坐標，繪制細胞劑量存活曲線。

1.9統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。擬合計算得到特征參數細胞的平均致死劑量(D0)、擬閾計量(Dq)、外推值(N)。

2 結 果

2.1X射線誘導形成CNE-2R情況 CNE-2R處于G1期的細胞數目較CNE-2相對減少，S期的細胞數目較CNE-2略有增加，但差異均無統計學意義(P>0.05)。CNE-2R處于G2/M期的細胞數比例明顯小于CNE-2細胞株(P<0.05)。見表1。CNE-2R與CNE-2細胞株吸光率及細胞相對增值率在無射線照射時無顯著差異(P>0.05)，在經過2、4、8 Gy照射后，CNE-2R細胞相對增值率、吸光率均明顯升高(P<0.05)。見表2。

表1 兩組細胞周期分布

表2 各組細胞吸光度和細胞相對增殖率

2.2CNE-2R與CNE-2細胞株蛋白表達差異 2DE結合質譜分析結果顯示：CNE-2與其誘導后生成的CNE-2R比較，有36個蛋白表達存在差異，其中23個上調，13個下調。見圖1。

2.3CNE-2R與I-210細胞株miR-210的相對表達量 I-210細胞株中miR-210的相對表達量(3.45±1.50)顯著低于CNE-2R(11.36±1.56)(P<0.05)。

2.4I-210 與CNE-2R細胞周期與細胞凋亡 與CNE-2R比較，I-210的G2/M期細胞數比例明顯增加(P<0.05)，S期細胞數明顯減少(P<0.05)，G1期差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。經過6 Gy照射，I-210細胞凋亡率〔(18.452±0.394)%〕顯著高于CNE-2R〔(9.293±1.002)%〕(t=3.179,P<0.05)。

2.5I-210與CNE-2R 細胞存活參數及SER I-210的N、D0、Dq值均低于CNE-2R細胞，見表4；SERD0=1.297，生存曲線見圖2。

圖1 蛋白表達差異

組別G1SG2/MCNE-2R72.352±1.86119.547±1.9455.347±0.805I-21069.938±1.36215.175±1.83612.573±0.712t/P值1.171/0.6285.582/0.02410.912/0.011

表4 兩組細胞存活參數

圖2 兩組細胞的生存曲線

3 討 論

3.1CNE-2R與CNE-2對比 本研究顯示從整體上二者之間是有放射敏感性差異的。細胞敏感性與其所處的細胞周期關系十分密切，細胞周期可分為G1、S、G2期(間期)和M期(分裂期)。研究表明〔8〕，細胞處于G1期和S期的放射敏感性最差其次為S期與G2期，而細胞處于G2后期和M期的放射敏感性最強。本研究提示與CNE-2細胞相比，CNE-2R對射線的敏感性顯著降低。CCK-8實驗檢測的細胞吸光度和增值率可以反映細胞的生存能力〔9〕，本研究結果顯示CNE-2R的生存能力較CNE-2高，更不容易被射線殺死。

3.2I-210與CNE-2R對比 miR-210作為miRNA中的重要一員，通過影響腫瘤相關基因的激活或抑制腫瘤細胞的凋亡影響著腫瘤的發生發展〔10〕。研究已發現了miR-210對各種癌癥(乳腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、頭頸癌)的影響，癌組織中miR-210的表達與10年生存率有關〔11～16〕，而miR-210異常表達可在復雜、極端的生理環境下穩定存在〔17〕。也有實驗已經表明miR-210在CNE-2R細胞株中有較高的表達〔18〕，與本文觀點一致。

本研究表明降低miR-210的表達可以通過增加細胞凋亡率來提升放射敏感度。單擊多靶模型很好地擬合了細胞存活曲線，被認為是判斷細胞放射敏感性的金標準〔19〕。本研究說明，下調miR-210，可以增加NPC細胞的敏感性。

綜上，通過降低miR-210的表達，可增強CNE-2R的放射敏感性。然而，miR-210降低NPC的放射敏感性的靶向基因尚未找到，具體機制尚未明確。除此另外，影響NPC的放射敏性的因素眾多，作用機制也很復雜，此次研究為離體實驗，并不能有效模擬生物體內環境中NPC的放射敏感性的變化，因此實驗結果是有一定的局限性，需要后期基因學實驗、動物實驗及臨床試驗等多方位、全面綜合的進一步研究。