血管性癡呆大鼠不同時間點模型的建立與評估

胡躍強 汪庭龍 向軍軍 賴菁菁 吳林 唐農

(1廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病一區，廣西 南寧 530023；2廣西中醫藥大學)

血管性癡呆(VD)是由各種腦血管疾病導致的獲得性、持續性智能障礙綜合征，其突出的臨床特點是學習和記憶等認知功能下降。隨著社會人口的不斷老齡化和腦卒中治療存活率的提高，亞洲老年癡呆中VD所占比例高于20%，成為導致癡呆的第二大原因〔1〕。因此，建立理想穩定的、易操作性、可復制的大鼠VD模型，對于了解VD的病理機制及臨床用藥的研究至關重要。而目前關于VD模型的制作方法尚無統一標準，常見有血管阻斷法、栓塞法、病理及危險因素結合等〔2，3〕，但都存在些許不足，尤其在時間點控制上。本實驗選用操作簡便，重復性強的二血管阻斷法建立3種大鼠VD模型，并對其各時間點的穩定性進行簡單評價比較。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康3月齡雄性SPF級SD大鼠110只，體重(250±50)g，購于廣西醫科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK桂2009-0002。隨機分為假手術組、缺血再灌注組(A組)，雙側頸總動脈結扎組(B組)，再灌注配合雙側結扎組(C組)。

1.2模型制備 假手術組：大鼠腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后頸正中切口，鈍性分離兩側頸總動脈，余不做任何處理，即可縫合傷口。A組：大鼠腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后頸正中切口，鈍性分離兩側頸總動脈，動脈夾阻斷血流20 min，然后恢復血流10 min，再阻斷血流20 min，如此重復3次。第3次血流恢復后觀察10 min，如生命征平穩，即可縫合傷口。B組：大鼠腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后頸正中切口，鈍性分離兩側頸總動脈，用4號絲線結扎兩側頸總動脈，生命征平穩后，可縫合傷口。C組：大鼠腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后頸部正中切口，鈍性分離兩側頸總動脈，動脈夾阻斷血流20 min，然后恢復血流10 min，再次阻斷血流20 min，如此重復3次。第3次血流恢復后用4號絲線結扎兩側頸總動脈。生命征平穩后可縫合傷口。

1.3試劑與儀器 水合氯醛分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；MT-200型 Morris 水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；TUNEL檢測試劑盒(北京中杉公司)；BX-60型研究級顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.4指標檢測

1.4.1Morris水迷宮行為學檢測 ①定位航行實驗：將Morris 水迷宮設4個象限，平臺于第二象限內，水位高于平臺2 cm。倒入墨汁，以從水面看不到平臺為準。每天每只大鼠依次游完4個象限，連練5 d。將大鼠尋找平臺的時間設置為120 s，若大鼠在120 s內找不到平臺，則逃避潛伏期為120 s。本實驗以第5天的潛伏期作為大鼠空間學習能力的檢測指標。②空間搜索實驗：于第6天撤走平臺，依次將大鼠從4個象限放入水中，分別記錄60 s內在目標區域停留時間及跨越平臺的次數作為空間記憶的評估指標。

1.4.2神經細胞凋亡檢測 大鼠斷頭分離海馬，用冰凍切片機將標本切為5 μm薄片，置于多聚賴氨酸載玻片，然后4%多聚甲醛液固定20 min，應用TUNEL試劑盒依照說明書的方法進行凋亡細胞檢測。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析或t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠術后死亡率的變化 術后B組大鼠死亡17只，死亡率56.7%；C組死亡7只，死亡率23.3%，明顯低于B組。假手術組死亡率(0)最低，A組次之〔3只(10.0%)〕。

2.2Morris水迷宮行為學結果

2.2.1定位航行實驗結果 術后1 w，與假手術組相比，3組模型大鼠的逃避潛伏期均顯著延長(P<0.05)，以C組最為突出，且A組與C組相比具有明顯差異(P<0.05)。但術后4 w開始，A組與假手術組比較無統計學差異(P>0.05)；與B、C兩組與A組及假手術組存在明顯差異(P<0.05)；同時也發現B、C兩組術后潛伏期均有下降趨勢，但組內比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.2.2空間搜索實驗結果 術后1 w，與假手術組相比，各組模型大鼠目標區域停留時間及跨越平臺的次數明顯減少，且以C組最為明顯(P<0.05)。術后4 w、8 w、12 w B、C兩組仍顯著低于假手術組(P<0.05)；而A組已接近假手術組水平(P>0.05)，且與B、C組存在明顯差異(P<0.05)。見表2。

2.3神經細胞凋亡的變化 術后1 w，與假手術組比較，各組模型大鼠細胞凋亡數目明顯增多(P<0.05)。從術后4 w開始，B、C兩組與假手術組、A組均存在明顯差異(P<0.05)；而A組與假手術組無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表1 各組定位航行學習能力的比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與A組比較：2)P<0.05；與B組比較：3)P<0.05；下表同

表2 各組空間搜索記憶能力的比較

表3 各組神經細胞凋亡數目比較

3 討 論

人類疾病的動物模型復制原則應遵循相似性、可行性、易行性和經濟性等。即復制的動物模型應力求可特異地反映人類某種疾病結構、功能、代謝等變化，具備該種疾病的主要癥狀和體征，且復制動物模型時，所采用的方法應盡量做到容易執行和合乎經濟原則〔4，5〕。上述原則中最基本是相似性與可行性，如果復制的動物模型不具備人類某種疾病的特點，或隨著時間推移它的特點逐漸消失，那其研究的有效性及觀察的價值就有待衡量。

本研究顯示A組大鼠術后1 w的學習記憶能力較假手術組顯著降低，但在術后4 w的這種差異性消失說明A組大鼠此時的學習記憶能力又有顯著提高，細胞凋亡的變化也證實了這一現象。這可能與大鼠大腦只有急性缺血再灌注損傷，而沒有長期低灌注缺血有關。Nishio等〔6〕在研究中也指出雙側頸總動脈狹窄的小鼠模型，術后2 h的腦血流量可暫時降至60%～70%，但在1～3個月可逐漸恢復大于80%。就目前結果，可推測A組大鼠存在自我修復的過程，隨著時間的推移這種模型復制的相似性與可行性消失，模型變得逐漸不成立，可能不利于長期動態的藥物評價及病理過程的研究。

本研究中B組模型，通過結扎雙側頸總動脈模擬長期慢性腦灌注不足引起腦損傷，誘發VD的發生。本研究數據也充分說明此種造模方法的大鼠術后學習記憶能力較同時段的假手術組明顯下降，符合了模型復制的相似性與可行性。而有趣的是本研究還發現B、C兩組大鼠在術后的潛伏期，穿越平臺次數，細胞凋亡方面均有輕微改善的趨勢，但對組間差異性的影響均可忽略不計，分析不排除存在自我修復的可能或者跟有氧運動改善認知障礙有關〔7〕，但這都需要實驗進一步去證實。

本研究C組大鼠通過急性缺血再灌注加上慢性低灌注狀態，導致大腦急性與漸進性缺血缺氧性損害。從造模機制上看符合臨床上常見腦卒中合并動脈粥樣硬化狹窄引起VD的發病特點。從其行為學、細胞凋亡評價來看，成績也最為穩定，具有良好復制的相似性與可行性。

綜上所述，3種模型在術后都能模擬VD學習記憶能力障礙的特點，但隨著時間推移A組腦功能恢復明顯，模型相似性、可行性降低，可能不利于長期動態的觀察，可考慮用于短期藥物與病理研究；B、C兩組術后均出現穩定的行為學與細胞凋亡的改變，說明兩組模型術后結構穩定，因此都可用于VD的長期動態研究。但是B組大鼠的死亡率明顯高于C組，考慮到經濟性，因此C組的造模方法可能更適合復制VD大鼠模型。