游泳訓練通過激活Nrf2/ARE/Glo-1通路改善糖尿病大鼠認知功能障礙

申夢麗 仇欣然 馬中軒 郝夢 劉耀武 魯茜

(徐州醫科大學江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

糖尿病腦病主要臨床表現為認知功能減退〔1〕。氧化應激是糖尿病腦病的重要發病機制。氧化應激的作用過程與非酶性蛋白糖基化緊密相關，兩者相互協同共同導致了糖尿病認知功能障礙的發生和惡化。乙二醛酶(Glo)-1是體內α-羰基醛的主要解毒酶，可及時清除丙酮醛(MG)等α-羰基醛，抑制晚期糖基化終末產物(AGEs)的生成，使機體免受糖化作用毒性，在糖尿病并發癥的預防和治療中發揮重要作用〔2〕。核轉錄因子(NF)-E2相關因子(Nrf)2是調節細胞抗氧化應激的重要轉錄因子，NF-E2通過抗氧化反應元件(ARE)相互作用調節編碼抗氧化蛋白，激活Nrf2信號通路對糖尿病并發癥有預防作用〔3〕。Xue等〔4〕報道，Nrf2/ARE通路可以編碼Glo-1基因。在高糖培養的大鼠原代海馬和皮質神經元中，激活Nrf2/ARE信號通路可上調Glo-1表達，從而發揮抗氧化應激和減少AGEs累積作用〔5〕。運動治療能夠降低血糖、改善胰島素抵抗、預防和治療并發癥，是治療糖尿病的重要措施〔6〕。在動物模型中，規律運動能夠通過激活Nrf2對骨骼肌、心肌、腎臟、肝臟等組織器官發揮保護作用〔7〕。此外，Aguiar等〔8〕研究發現，在帕金森模型小鼠中，6 w的跑步機訓練能激活大腦黑質紋狀體中的Nrf2/ARE信號通路，發揮神經保護作用。然而，游泳訓練對糖尿病腦病是否具有神經保護作用，目前尚未見報道。本研究觀察了游泳訓練對糖尿病大鼠認知功能的影響，并從Nrf2/ARE/Glo-1途徑研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 Ⅰ型膠原蛋白酶、鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，核漿蛋白分離試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，抗體Glo-1、Nrf2、Lamin B1均購自英國Abcam公司，抗體β-actin購自美國Bioworld公司。Morris水迷宮系統購自美國Coulbourn instruments公司，單管型多功能檢測儀購自美國Promega Biosystems公司，雙色紅外激光成像系統購自美國LI-COR公司。

1.2實驗動物 6周齡無特異病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠56只，體重160～210 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK(滬)2013-0016。實驗動物在徐州醫科大學實驗動物中心屏障系統分籠飼養，自由進食飲水。

1.3分組及訓練模型制備 隨機取6只大鼠為正常組，其余采用高糖高脂飼料喂養，8 w后給予低劑量STZ 30 mg/kg腹腔注射。STZ注射72 h后眼眶采血，測定空腹血糖≥13.9 mmol/L為糖尿病大鼠模型制備成功。將造模成功的糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組(DM，n=12)和游泳訓練組(n=38)。所有游泳訓練組大鼠需進行1 w適應性游泳訓練，并逐天增加其訓練時間(分別為10、20、30、40、50、60、70 min/d)。隨后隨機分為低強度游泳(LM)組(n=13)，中強度游泳(MM)組(n=12)、高強度游泳(HM)組(n=13)，3組每周進行5次無負重游泳訓練，訓練時間分別為30 min/次、60 min/次、120 min/次，共8 w。游泳水溫為25.5℃±0.5℃，水池直徑150 cm，水深35 cm。

1.4學習記憶能力測試 在游泳訓練8 w后，對各組大鼠采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學習記憶能力〔9〕。定位航行試驗：先進行連續4 d的獲得性訓練，將大鼠分別從4個象限放入水中，并且頭朝池壁入水。記錄大鼠尋找到隱藏在水面下平臺所需要的時間(稱潛伏期)。設定最長游動時間為90 s。90 s未找到平臺者，將其引導至平臺，放置20 s，引導其學習與記憶。分析潛伏期，考察學習能力?？臻g探索試驗：第5天進行空間探索實驗，測試記憶能力。撤掉隱藏平臺，從之前平臺的對側象限將大鼠放入水中。在90 s內記錄大鼠穿過平臺位置的次數及目標象限所占時間百分比。

1.5氧化應激指標測定 在水迷宮實驗完成后即刻斷頭處死大鼠，取大鼠腦海馬組織，以磷酸鹽緩沖液(PBS)制成10%勻漿液，3 500 r/min、4℃離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書檢測T-SOD酶活力及GSH含量。

1.6AGEs含量測定 將海馬組織沉淀物用雙蒸水洗滌3次，然后加入氯仿/甲醇混合液(1∶1)1 ml，37℃恒溫震蕩過夜。離心去上清，沉淀中加入0.5 ml甲醇/水混合液(4∶1)，6 000 r/min、4℃離心5 min。將沉淀分別用甲醇洗滌2次，用雙蒸水洗滌1次。然后將沉淀物用0.02 mol/L Hepes緩沖液(含0.1 mol/L氯化鈣)洗滌2次，后加入1 ml 0.02 mol/L Hepes緩沖液4℃過夜。離心去上清，沉淀物中加入1 ml Hepes緩沖液(含290 U I型膠原酶、2 μl甲苯、2 μl氯仿)，37℃恒溫震蕩24 h。離心取上清，用熒光分光光度法測定AGEs含量，激發光波長和吸收光波長分別為370 nm、440 nm。以只含Ⅰ型膠原酶的Hepes緩沖液為空白管，結果以熒光單位AUF/mg蛋白表示，所用儀器為單管型多功能檢測儀。

1.7海馬組織Nrf2、Glo-1表達檢測 取大鼠腦海馬組織，放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液：蛋白酶抑制劑(PMSF)=100∶1配置勻漿液，配好的勻漿液(ml)：組織重量(g)=5∶1，冰浴中勻漿，并在冰上裂解30 min，勻漿液于10 700 r/min，4℃離心15 min后取上清；嚴格按照核漿分離試劑盒說明書進行海馬組織核漿分離。采用二喹林甲酸(BCA)法進行蛋白濃度測定。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，半干轉至硝酸纖維素(NC)膜上，3%脫脂奶粉封閉1 h。再分別與兔抗Nrf2多克隆抗體(1∶750)、兔抗Lamin B1單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗Glo-1單克隆抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000) 4℃反應過夜。洗膜，加入二抗(1∶1 000)，室溫避光孵1 h。將條帶用雙色紅外激光成像系統掃描，保存所得圖像，用Image J軟件進行光密度分析，以Glo-1，Nrf2與內參光密度的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8統計學方法 采用SPSS16.0軟件進重復測量方差分析、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1游泳訓練對糖尿病大鼠學習記憶能力的影響 在定位航行試驗中，DM組逃避潛伏期明顯高于正常組(P<0.01)。與DM組相比，LM組逃避潛伏期在第2～4天明顯降低(P<0.01)；MM組逃避潛伏期在第1～3天明顯降低(P<0.05或P<0.01)；HM組逃避潛伏期在第1～4天內均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。在空間探索實驗中，DM組穿過平臺位置的次數和目標象限時間百分比明顯低于正常組(P<0.05或P<0.01)。與DM組相比，MM組和HM組穿過平臺位置次數和目標象限時間百分比明顯增高(P<0.05)。見表1。

表1 Morris水迷宮實驗結果

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與DM組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同；5)Morris水迷宮實驗后存活大鼠只數

2.2游泳訓練對糖尿病大鼠海馬組織抗氧化作用的影響 與正常組相比，DM組大鼠海馬中T-SOD酶活力和GSH水平顯著性降低(P<0.01)。與DM組相比，LM、MM、HM組的T-SOD酶活力顯著性升高(P<0.05或P<0.01)，LM、MM組的GSH水平則顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 游泳訓練對糖尿病大鼠海馬組織抗氧化酶活力的影響

2.3游泳訓練對糖尿病大鼠海馬中AGEs水平的影響 與正常組相比，DM組大鼠海馬組織中AGEs相對含量明顯升高(P<0.01)。與DM組相比，MM、HM組大鼠海馬組織中AGEs均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表3。

2.4游泳訓練對糖尿病大鼠海馬組織胞核和胞質中Nrf2表達的影響 與正常組相比，DM組大鼠胞質胞核Nrf2表達減少(P<0.05)。與DM組相比，MM、HM組大鼠海馬組織中胞質Nrf2表達減少(P<0.05)，胞核Nrf2表達量明顯高于DM組(P<0.05或P<0.01)。見表3、圖1。

2.5游泳訓練對糖尿病大鼠海馬組織中Glo-1表達的影響 與正常組(0.91±0.17)相比，DM組大鼠海馬組織中Glo-1表達(0.57±0.15)顯著減少(P<0.01)。與DM組相比，MM、HM組大鼠海馬中胞質Glo-1表達(0.88±0.25、0.80±0.24)顯著增加(P<0.01或P<0.05)。LM組(0.77±0.12)與DM組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

表3 游泳訓練對糖尿病大鼠海馬組織中AGEs及Nrf2蛋白水平的影響

圖1 游泳訓練對糖尿病大鼠海馬組織胞質和胞核中Nrf2蛋白表達的影響(n=6)

圖2 游泳訓練對糖尿病大鼠海馬組織中Glo-1蛋白表達的影響(n=6)

3 討 論

運動療法在2型糖尿病患者的血糖控制、體重減輕和并發癥預防等方面扮演著重要角色〔9〕。Reisi等〔10，11〕的研究發現12 w的跑臺運動可以預防和改善糖尿病大鼠認知功能減退，其潛在機制尚不清楚。本實驗表明中高強度游泳訓練能夠發揮腦神經保護作用，明顯改善了糖尿病大鼠學習記憶能力。

研究發現，糖尿病患者處于長期高血糖和氧化應激狀態，產生大量的MG，并累積生成AGEs〔12〕。MG和AGEs具有很強的糖化活性，可修飾蛋白質引起細胞毒性和組織損傷，進而使細胞、組織形態與功能發生改變，在糖尿病并發癥的發生發展中起著關鍵作用〔2〕。Glo-1是體內α-羰基醛代謝系統的限速酶，與Glo-2和輔因子還原型GSH組成乙二醛酶系統〔12〕。該系統在GSH的參與下，將高糖化活性的α-羰基醛催化生成相應的無糖化活性的α-羥基酸，是體內α-羥基醛的主要解毒系統〔2〕。Brouwers等〔13〕研究發現，在糖尿病大鼠中，過表達Glo-1能夠降低高糖誘導的AGEs和氧化應激水平。Glo-1在抑制AGEs形成中起關鍵作用，是防治糖尿病并發癥的靶點〔2〕。本實驗提示游泳訓練可以通過增強Glo-1表達、減少MG的蓄積、抑制AGEs的生成，延緩糖尿病腦病病情進展。

Nrf2通過與ARE相互作用調節編碼抗氧化蛋白，是迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路，激活Nrf2/ARE信號通路后能夠調節下游多種保護基因的表達〔14〕。研究表明〔4〕，Glo-1是Nrf2/ARE信號通路的下游靶基因。在高糖條件下培養的海馬和皮質神經元中，Nrf2誘導劑可以通過激活Nrf2/ARE信號通路增強Glo-1功能。本實驗結果顯示游泳訓練很可能是通過激活Nrf2/ARE信號通路，進而增強下游Glo-1蛋白表達，減少AGEs蓄積，對抗氧化應激，發揮保護防御作用。

綜上，中高強度游泳訓練能夠明顯提高糖尿病模型大鼠的學習記憶能力，并且這種改善作用可能是通過激活Nrf2/ARE通路，增強通路下游Glo-1蛋白表達，抑制氧化應激和非酶糖基化實現的。