葛根素調控p38信號通路對H2O2誘導心肌細胞凋亡的影響

謝民 李社芳 邢海燕 謝翀

(河南中醫藥大學 1中醫基礎理論教研室，河南 鄭州 450003；2第一附屬醫院腦病中心；3第一附屬醫院腎病科；4河南省實驗中學)

心腦血管疾病具有高度致殘率、復發率和死亡率，且有較多的并發癥〔1〕。氧化應激與多種心血管疾病的發生和發展存在密切聯系。有研究顯示，心肌缺血再灌注、心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病在病理條件下可產生大量的活性氧及氧自由基，引起心肌細胞發生氧化應激損傷及凋亡或壞死，從而使病情加重〔2，3〕。降低心肌細胞的氧化應激引起的損傷和凋亡對于心血管疾病的治療具有重要意義。大量研究顯示，葛根素可通過抗細胞凋亡、改善內皮功能、抗氧化應激等對多種心臟疾病起到防治作用〔4，5〕。葛根素可通過活化PI3K/AKT信號降低或抑制核轉錄因子(NF)-κB信號通路降低由缺血再灌注損傷引起的心肌細胞凋亡〔6，7〕。p38信號通路介導了細胞的多種生理及病理過程，抑制該信號通路可降低心肌細胞的凋亡〔8〕，但葛根素是否可通過抑制p38信號通路影響H2O2誘導的心肌細胞凋亡還未清楚。本研究旨在探討葛根素通過p38信號通路對H2O2誘導心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細胞 大鼠H9c2心肌細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清購自美國Gibco；DMEM培養基購自美國HyClone；胰蛋白酶購自美國Thermo；SB203580購自Premaga；葛根素由中國藥品生物制品檢定所提供；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、電化學發光(ECL)試劑均購自武漢博士德；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(酶切caspase3)、p53、p-p38抗體購自美國Epitmics。

1.3細胞培養及分組 取出保存在液氮罐中的H9c2心肌細胞進行常規復蘇，復蘇后用DMEM培養液(含有濃度為10%的小牛血清及100 g/L的雙抗)于5%體積分數CO2細胞培養箱中37℃培養，每2～3 d換液1次，選擇對數生長期的H9c2心肌細胞，分為對照組、H2O2組和葛根素+H2O2組，其中對照組細胞無特殊處理，H2O2組用200 μmol/L H2O2干預細胞，葛根素+H2O2組用250 μmol/L葛根素和200 μmol/L H2O2干預細胞。各組均設置10個復孔，收集處理24 h的3組細胞用于后續實驗研究。

1.4細胞凋亡檢測 收集處理24 h的1.3分組中的3組細胞，參照FITC標記的Annexin V和PI雙染色細胞凋亡試劑盒說明，首先用胰蛋白酶消化細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞后離心收集細胞，加入結合緩沖液200 μl于離心后的細胞沉淀中，并吹打細胞制備成單細胞懸液，分別加入Annexin V-FITC和PI試劑各5 μl，輕輕混合均勻，于避光環境室溫反應5～15 min，1 h內上流式細胞儀進行凋亡檢測。實驗重復3次。

1.5酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表達檢測 將適量的細胞裂解液加入按照1.3分組處理24 h的3組細胞，置于冰上反應30 min，離心后收集蛋白。BCA試劑盒檢測提取的蛋白濃度。將蛋白置于100℃煮沸變性10 min，在每泳道加入等量的變性蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離，后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入一抗4℃過夜，其中酶切caspase3、p53、p-p38蛋白的稀釋比例均為1∶500，內參GAPDH稀釋比例為1∶1 000，次日加入稀釋好的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗在室溫環境孵育1 h，ECL試劑盒顯影，化學發光成像系統掃描分析各蛋白相對于內參GAPDH的表達量。

1.6葛根素抑制p38信號通路對H2O2誘導心肌細胞凋亡的影響 SB203580作為p38信號通路抑制劑，通過上述方法檢測葛根素+H2O2處理組及葛根素+H2O2+SB203580(5 μmol/L)處理組心肌細胞的凋亡情況及酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表達情況。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1葛根素對H2O2誘導H9c2心肌細胞凋亡的影響 與對照組(1.26%±0.23%)比較，H2O2組細胞凋亡率(12.97%±1.02%)顯著升高(P<0.05)，與H2O2組比較，葛根素+H2O2組(4.88%±0.39%)顯著降低(P<0.05)。

2.2葛根素對H2O2誘導H9c2心肌細胞酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表達的影響 與對照組比較，H2O2組酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，與H2O2組比較，葛根素+H2O2組均顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 葛根素對H2O2誘導的H9c2心肌細胞酶切caspase、p53、p-p38蛋白表達的影響

組別酶切caspase3p53p-p38對照組0.023±0.0060.120±0.0150.038±0.007H2O2組0.189±0.0231)0.367±0.0411)0.173±0.0181)葛根素+H2O2組0.126±0.0162)0.223±0.0212)0.082±0.0092)

與對照組比較：1)P<0.05；與H2O2組比較：2)P<0.05

2.3葛根素抑制p38信號通路對H2O2誘導心肌細胞凋亡的影響 與葛根素+H2O2組(4.82%±0.40%)比較，葛根素+H2O2+SB203580組細胞凋亡率(1.83%±0.20%)顯著降低(P<0.05)。

2.4葛根素抑制p38信號通路對H2O2誘導心肌細胞酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表達的影響 與葛根素+H2O2組比較，葛根素+H2O2+SB203580組酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 葛根素抑制p38信號通路對H2O2誘導心肌細胞酶切caspase3、p53、p-p38蛋白表達的影響

組別酶切caspase3p53p-p38葛根素+H2O2組0.114±0.0160.227±0.0250.094±0.010根素+H2O2+SB203580組0.053±0.0081)0.156±0.0171)0.033±0.0071)

與葛根素+H2O2組比較：1)P<0.05

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷發生后可引起心肌細胞內的線粒體結構損傷、氧自由基增多等一系列的生理及病理學發生，最終引起心肌細胞發生凋亡或死亡〔9〕。而氧化應激起到重要的影響作用。活性氧可參與細胞生長、凋亡、分化等過程，生理及病理狀態下活性氧過量產生可引起生物功能的缺失及線粒體功能發生障礙，從而導致心肌細胞發生損傷，當心肌細胞在大量活性氧中長期暴露可引起細胞的凋亡、肥大、壞死，最終引起心肌重構、心律失常等心血管疾病〔10，11〕。多項研究也發現，降低心肌細胞中活性氧水平可明顯抑制細胞凋亡〔12，13〕。因此，降低由活性氧引起的心肌細胞凋亡對于心血管疾病治療尤為重要。葛根素是葛根的主要活性成分。有研究顯示，葛根素可通過降低心肌細胞的氧化損傷及抑制細胞凋亡信號通路來降低表柔比星引起的心肌毒性〔14〕；可通過活化PI3K/AKT信號降低或抑制NF-κB信號通路降低由缺血再灌注損傷引起的心肌細胞凋亡〔6，7〕。MAPK信號通路是體內一個重要的信號轉導系統，參與細胞生長、分化、發育等多方面，p38MAPK所介導的通路是一種磷酸化級聯反應，可對多種生物學活性進行調節。研究顯示，在心肌缺血再灌注損傷中p38MAPK信號被激活，從而加重心肌細胞損傷，而抑制該信號通路可降低心肌細胞的凋亡〔15，16〕。

在氧化應激模型中H2O2是常用的誘導劑，本研究前期預實驗使用200 μmol/L H2O2的作用濃度與Wang等〔17〕在研究中使用的濃度一致。本研究結果發現葛根素可明顯降低由H2O2刺激引起的心肌細胞的凋亡。SB203580為一種吡啶咪唑類抑制劑，可特異性阻止或抑制p38MAPK的活性。研究顯示，SB203580可明顯降低心肌梗死及缺血程度，抑制心肌細胞的凋亡〔18〕。本研究結果提示葛根素可通過抑制p38MAPK信號降低H2O2誘導的心肌細胞凋亡。在心肌細胞凋亡中凋亡相關基因caspase3、p53等均起到重要調控作用。在多種因素引起的心肌細胞凋亡中線粒體激活的caspase途徑是其中的一條途徑，而引發的caspase級聯反應最終可激活caspase3、6和7而引起細胞發生凋亡〔19〕。p53是一個凋亡促進基因，在多種心血管損傷疾病中表達升高，且可誘導心肌細胞凋亡〔20，21〕。本研究結果顯示，葛根素可降低由H2O2刺激引起的心肌細胞酶切caspase3和p53表達的升高，加入SB203580后降低其表達效果更明顯。

綜上，葛根素可通過抑制p38信號通路及下調酶切caspase3和p53表達降低H2O2誘導的心肌細胞凋亡。