小鼠骨髓細胞有絲分裂染色體標本制備方法的優化

高振華，吳浩浩，趙志輝，許英梅，Aguzey Harry，程貴蘭，生 冉，許嫣紅

(廣東海洋大學農學院，廣東湛江 524088)

細胞染色體是細胞核中穩定且重要的成分，是生物遺傳物質的載體，其數目與形態是研究生物進化、遺傳變異、個體發育、疾病預防、病因發生、疾病診斷和治療等的基礎手段[1-3]。染色體標本的制備是進行染色體核型分析、帶型分析和檢測遺傳學相關疾病的前提[4-7]。小鼠因其繁殖周期短、產仔數多、成熟早、個體小、易操作、成本低且與人類基因相似度高等特點[8-10]，是人類疾病研究的首選動物模型，骨髓細胞因數量多、取材方便、分裂增殖性強、不需要進行無菌操作和體外培養，方法簡捷而成為進行染色體標本制備的理想材料[11-13]，也是各高校用于細胞遺傳類教學的首選實驗方法。僅從低滲處理步驟開始至染色前，所需要的時間大約140 min，耗時長，從而導致學生實驗不好安排，人們也在嘗試優化和改進實驗方法，以減少實驗持續時間，但以前的研究大多集中于取樣部位的選取、離心條件改變、低滲溶液濃度改變、固定液濃度改變等[14-17]，固定次數和固定時間對實驗時間的影響研究鮮見報道。為此，筆者對制片操作過程中的固定環節進行了適當優化，以縮短操作時間。

1 材料與方法

1.1實驗動物選擇4～8周齡小鼠，性別不限。

1.2器材與試劑

1.2.1器材。解剖板、解剖剪、大小鑷子、吸管、離心管、培養皿、預冷載玻片、酒精燈、擦鏡紙、恒溫水浴箱、TDL-5 型離心機。

1.2.2試劑。秋水仙素200 μg/mL、2%檸檬酸鈉溶液、0.075 mol/L KCl 低滲溶液、甲醇乙酸(3∶1)固定液、Giemsa 染液。

1.3方法

1.3.1預處理。在預實驗的基礎上，共選取4～8周齡的健康小鼠201只，公母不限，隨機分為3組，分別1次固定38只(60 min)、2次固定123只(30、25 min))和3次固定41只(30、25、15 min)，其他操作步驟不變。具體操作步驟按照《動物遺傳學實驗教程》[18]進行。

1.3.2實驗程序。①注射秋水仙素：在試驗開始前3～4 h 給小鼠腹腔注射秋水仙素，注射劑量為每只小鼠注射200 μg/mL的秋水仙素0.4 mL。②處死小鼠，收集骨髓細胞：采用頸部移位法處死小鼠，后腿中間剪開皮膚和肌肉，從后肢根部取出股骨置于培養皿中，分離去除附在骨上的肌肉。用2%檸檬酸鈉清洗干凈，剪掉股骨兩端股骨頭，暴露骨髓腔，用注射器吸取2%的檸檬酸鈉5 mL，反復沖洗骨髓腔至股骨變白，將沖洗液置于離心管中離心，去除上清液留沉淀。③低滲處理：在細胞懸液中加入5 mL 0.075 mol/L的 KCl溶液6 mL，將細胞吹打1次，在37 ℃下水浴30 min，中間吹打1次；1 000 r/min離心10 min。④固定：加入3∶1的甲醇-冰醋酸固定液進行固定，具體方法包括1次固定(60 min)、2次固定(30、25 min)和3次固定(30、25、15 min)。最后一次固定后離心，棄去上清液，加入3∶1的甲醇-冰醋酸固定液2～3滴(視細胞數量適當增減，大約相當于 5倍細胞的體積)，搖勻制成細胞懸液。⑤滴片：取事先預冷(-20 ℃)的載玻片，迅速從約30 cm 高處滴加細胞懸液1～2 滴，輕輕吹散，酒精燈上過火2～3次(切勿過熱烤干)，風干。⑥染色：取風干后的薄片置于玻璃板上，滴滿Gimesa染液(0.5 mL Gimesa原液加入9.5 mL 0.01 mol/L PBS，pH 6.8)于載玻片上，染色30 min后用蒸餾水沖洗，晾干后觀察。

1.4數據處理數據以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著；采用Duncan’s多重比較進行顯著性分析。

2 結果與分析

對固定環節進行優化，分為3種固定方法，具體結果見表1。

表1 不同固定方法的效果比較

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)

Note：Different small letters in the same column indicated significant differences(P< 0.05)

1次固定染色體制片成功率為75.00%，制片效果不佳，染色體不清晰，重疊，排列不整齊，過于分散不集中；2次固定染色體制片成功率為82.10%，染色體數目清楚，結構清晰，分散充分而適度，沒有疊加；3次固定染色體制片成功率為82.90%，染色體長度適中，數目分明，染色體形態可見，整齊排列不疊加。從制片成功率和和染色體標本制備的質量來看，2次固定和3次固定的效果均好于1次固定，且2次固定和3次固定的效果差異不明顯(P<0.05)。3種固定方法的視野中骨髓細胞數量差異不顯著。染色體中期分裂相細胞數量的變化與視野中骨髓細胞數量相一致，多次固定的效果也顯著優于1次固定(P<0.05)。

3 討論

小鼠骨髓細胞的染色體制備是細胞遺傳學、細胞工程類課程的基本實驗方法，用于染色體結構和功能分析及操作，從秋水仙素的注射、骨髓細胞的獲取以及低滲處理、固定及滴片的環節都要求精細操作，但固定操作環節耗時最長，一般教材提供的方法大多是3次固定，固定時間分別為30、25和15 min，在每次固定后需要離心10 min，僅固定環節就耗時100 min。因此，基于HACCP(危害分析與關鍵點控制)理論分析，固定次數和固定時間是制約整個實驗的關鍵因素，直接影響實驗所用時間的長短，也是實驗程序優化的關鍵環節，因此在多次預實驗后確定可行的3個固定程序。該研究發現，1次固定效果不佳，染色體形態模糊不清，染色體易離散不集中，染色體邊緣起毛等現象導致觀察效果不佳，不適用于染色體核型分析。研究表明，無論是小鼠骨髓細胞、蟾蜍骨髓細胞等動物的同一部位染色體制備，還是小鼠不同部位的細胞，大多采用2次固定或3次固定。這可能是因為1次固定甲醇-冰醋酸固定液未能充分透過細胞膜發揮作用，影響制備效果。經觀察發現，采用2次固定和3次固定時，標本均著絲點位置清晰，染色體明顯伸展、不纏繞，排列整齊，形態清楚可見。制備麻雀、鵪鶉骨髓細胞和羊水細胞的染色體標本[14-17]等采用了2次固定，而用3次固定制備小鼠雄性生殖細胞染色體標本[18]也能獲得清晰的染色體樣本，說明2種固定方法在試驗操作中均獲得較理想的效果。究其原因，這可能是因為多次固定可使固定液與細胞充分混勻并進入細胞，對染色體起到固定作用，防止染色體蛋白質自溶，并能增強染色體的嗜堿性，使染色體形態清晰，能夠很好地分散[19-22]，提高染色體結構的可見度，改善對小鼠骨髓染色體核型分析的觀察效果。然而，從操作時間來看，2次固定用時75 min，比3次固定所需時間(100 min)減少了25 min，節省了時間，便于課堂的實驗安排。從節約時間、提高效率、節省人力等綜合因素考慮，制備小鼠骨髓細胞有絲分裂染色體標本的最佳固定方法為2次固定。

固定的目的在于盡快使細胞的結構固定于接近存活的狀態，以便進行下一步處理，防止細胞內蛋白質分解導致結構變化。冰醋酸滲透力強，固定迅速，可阻止染色體收縮，使染色體結構免于破壞，但易使組織膨脹。甲醇能迅速穿透組織使組織收縮，2種溶液按一定比例混合，既能保證固定效果，又能保證染色體的鋪展。但若固定時間太長，可能會導致細胞破裂、染色體片段的過分膨脹及染色體散失。這也是一次長時間固定的觀察中細胞總數和分裂相細胞少的原因。

動物實驗程序是一個不斷完善的過程，在進行該實驗時發現多個步驟尚有待進一步優化與探索。

4 結論

小鼠骨髓細胞有絲分裂染色體標本制片可采用2次固定的方法，固定時間分別為30、25 min。