花椒窄吉丁高發期3種花椒果實揮發物的提取與鑒定

王延來，謝壽安，賴 青，鞏雪芳，楊 平，呂淑杰，李 冬

(西北農林科技大學，陜西楊陵 712100)

花椒窄吉丁(AgriluszanthoxylumiHou)隸屬于鞘翅目(Coleoptera)吉丁蟲科(Bupresdae)窄吉丁屬(Agrilus)，主要分布于我國北方主要的花椒產業區，以陜西、甘肅發生嚴重[1]，在山西、山東、河南、四川等省也有大范圍分布。該蟲發生規律為一年一代，幼蟲取食韌皮部[2]，老熟后在花椒蛀干木質部的孔道中過冬，次年2月至4月上旬開始活動，下旬開始化蛹，5月上旬為化蛹初期，中下旬為化蛹盛期， 6月中下旬為羽化盛期，7月中旬至8月初基本羽化完畢，成蟲體多具有褐色或灰褐色金屬光澤。雌蟲多產卵于樹皮縫隙或樹枝分叉處，少數雌蟲產卵于近主干側枝的葉面下。幼蟲危害可持續至11月下旬，然后陸續越冬，整個幼蟲時期長達240～280 d[3]?；ń氛H危害3年生以上的花椒苗木，或干徑1.5 cm以上的枝干，以樹干直徑大小為依據，凍害有利于蟲害的發生[4]。研究發現，花椒窄吉丁的危害程度與所分布椒園的地勢和地形無關[5]。目前國內對花椒窄吉丁的研究，大多集中于化學防治[6-7]、生物學特性及其綜合防治方面[8-9]，對花椒窄吉丁觸角感器和花椒窄吉丁天敵的研究也有相關報道[10-11]，但利用生物信息素對花椒窄吉丁的防治研究甚少，僅車顯榮[12]于2018年首次利用信息素對花椒窄吉丁進行田間誘捕，結果表明花椒窄吉丁可被乙酸芳樟酯、α-水芹烯、月桂烯、(1R)-(+)-檸檬烯和順-9-十六烯醛等氣味物質引誘，且引誘效果較好。

植物揮發物對昆蟲的影響主要表現在昆蟲的定向、取食、交配、產卵等多種行為過程中，這是植物與昆蟲長期選擇、協同進化的結果[13]。不同品種寄主植物揮發物化學組分和相對含量不同，陳智明等[14]利用氣相色譜-質譜聯用法對長葉刺葵、絲葵和軟葉刺葵3種棕櫚科植物揮發物進行鑒定，結果發現揮發物組分主要為醇類和萜烯類，此外還包括酯類、醛類和烷烴等。孫浩然等[15]對羅勒、紫羅勒、丁香羅勒和綠羅勒4種羅勒進行揮發物的分析與鑒定，結果發現羅勒、紫羅勒、丁香羅勒和綠羅勒的葉片揮發物中分別檢測出28、31、30和25種物質，主要為萜烯類、醇類、醛類和酯類化合物，且不同種羅勒揮發物成分的種類和釋放量間存在明顯差異。寄主果實揮發物可能為昆蟲找尋食源、棲息地和產卵地提供有力信號[16]，目前已經發現楊梅不同成熟度的果實及其揮發物對斑翅果蠅的定向行為有重要的影響[17]；井上蛀果斑螟更傾向于在寄主果實中產卵[18]。

利用昆蟲信息素防治害蟲具有靈敏度高、選擇性強、無毒、不污染環境、不殺傷天敵、不易產生抗藥性等優勢，是一種新型防治技術，已成為當今世界害蟲綜合管理的主要方向之一[19-20]；特別是利用信息素大量誘捕害蟲和干擾害蟲的交配研究已有較多報道。筆者通過對鞘翅目昆蟲花椒窄吉丁高發期不同品種的寄主果實揮發物進行提取、分析與鑒定，旨在為篩選花椒窄吉丁類信息素化合物引誘劑或驅避劑及其寄主選擇機制研究和綠色防控技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1花椒果實及供試昆蟲?；ń饭麑嵱?018年6月下旬(藍田縣花椒窄吉丁高發期)采集自陜西省西安市藍田縣普化鎮山地附近的花椒園，選取大紅袍椒、鳳椒和獅子頭椒3個品種的植株，剪下花椒植株東西南北中5個方位的果實，分別裝入采集袋中密封帶回實驗室，-4 ℃保存。花椒窄吉丁成蟲于2018年6月下旬采自陜西省西安市藍田縣普化鎮附近山地的椒園。借助捕蟲工具捕捉棲息在葉片上的成蟲，而后根據其體型大小放入事先扎好孔的1.5 mL或2 mL離心管中，內置1片新鮮嫩葉供其取食，并編號放入蟲籠中。帶回實驗室于體視鏡下區分成蟲性別， 25 ℃下飼養，定期清理死蟲、糞便和更換新鮮椒葉。

1.1.2儀器與設備。氣相色譜-質譜聯用儀GC-MS(型號：GCMS-QP2010SE；生產廠家：島津科技科技有限公司；日本)。固相微萃取(SPME)裝置：SPME手動進樣手柄，采用DVB/CAR/PDMS萃取頭(纖維頭)(美國Supelco公司)；固相微萃取攪拌加熱平臺、20 mL螺紋鐵蓋進樣瓶、植物組織研磨儀、濾紙、DB-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、微量進樣器、分析天平等。

1.2方法

1.2.1揮發物的制備。將3種品種(大紅袍椒、鳳椒、獅子頭椒)花椒果實剪碎，分別置于分析天平上，稱取4.5 g，放入植物組織研磨儀進行研磨，至小顆粒狀或半固體勻漿狀。而后放置于20 mL螺紋鐵蓋樣品瓶中，約占瓶身的50%。加蓋密封后，置于50 ℃的恒溫臺上平衡10 min，保證樣品瓶上部的揮發性氣味物質充分飽和，然后將固相微萃取(SPME)裝置的針頭插入樣品瓶中上部的空白處，輕輕地推出纖維頭并固定固相微萃取裝置的手柄，從萃取纖維頭推出后開始計時，吸附30 min后，利用GC-MS于250 ℃下解析3 min。

1.2.2揮發物的GC-MS分析與鑒定。采用直接進樣法，利用氣象色譜-質譜聯用儀GC-MS對花椒果實揮發物進行提取與分析。GC條件：色譜柱利用DB-5ms毛細管柱(30 m×0.25 mm ID，膜厚0.25 μm)。進樣量為10 μL，進樣口溫度為250 ℃；柱溫箱升溫程序：60 ℃保持2.5 min，6 ℃/min升至190 ℃，然后以10 ℃/min升溫至 230 ℃，維持 10 min，載氣為高純He(99.999%)。

MS 條件：電子轟擊離子源 (EI )，電子能量為70 e V，掃描質量范圍為35～400 amu。各揮發物成分與質譜庫 (NIST2011 )標準化合物的質譜圖進行核對，然后根據有關花椒揮發物研究的文獻做參照，進而確定各色譜峰對應的物質結構，根據峰面積歸一化法進行定量。

2 結果與分析

2.1花椒果實揮發物的GC-MS分析

2.1.1大紅袍椒。通過GC-MS對大紅袍椒果實揮發物進行定性定量分析，發現大紅袍椒果實揮發物中共鑒定出74種物質，占峰面積的99.92%，總離子圖見圖1。由圖1可知，烯類化合物25種(總量86.67%)，以d-檸檬烯的相對含量最多(30.87%)；醇類化合物17種(總量9.50%)，以Gamma-萜品醇的相對含量最多(7.32%)；酯類化合物14種(總量2.35%)，以(±)-α-乙酸松油酯的相對含量最多(1.15%)；烷類化合物7種(總量0.29%)；醛類化合物6種(總量0.33%)；酮類化合物1種(總量0.87%)；萘類化合物2種(總量0.11%)；氯類化合物1種(總量0.01%)；其他化合物1種(總量0.03%)。

圖1 大紅袍椒果實揮發物總離子圖Fig.1 The volatiles total ion of Zanthoxylum bungeanum Dahongpao fruit

2.1.2鳳椒。通過GC-MS對鳳椒果實揮發物進行定性定量分析，發現鳳椒果實揮發物中共鑒定出64種物質，占峰面積的99.95%，總離子圖見圖2。由圖2可知，烯類化合物25種(總量60.48%)，以d-檸檬烯的相對含量最多(33.82%)；醇類化合物13種(總量14.56%)，以Gamma-萜品醇的相對含量最多(8.57%)；酯類化合物13種(總量23.83%)，以乙酸芳樟酯的相對含量最多(20.99%)；烷類化合物7種(總量1.11%)；醛類化合物3種(總量0.06%)；酮類化合物1種(總量0.11%)；萘類化合物1種(總量0.05%)；其他化合物1種(總量0.03%)。

圖2 鳳椒果實揮發物總離子圖Fig.2 The volatiles total ion of Zanthoxylum bungeanum Feng fruit

2.1.3獅子頭椒。通過GC-MS對獅子頭椒果實揮發物進行定性定量分析，發現獅子頭椒果實揮發物中共鑒定出77種物質，占峰面積的99.99%，總離子圖見圖3。由圖3可知，烯類化合物26種(總量86.51%)，以d-檸檬烯的相對含量最多(32.21%)；醇類化合物19種(總量9.13%)，以Gamma-萜品醇的相對含量最多(5.69%)；酯類化合物14種(總量3.17%)，以(±)-α-乙酸松油酯的相對含量最多(1.22%)；烷類化合物9種(總量0.52%)；醛類化合物5種(總量0.28%)；萘類化合物3種(總量0.20%)；苯類化合物1種(總量0.11%)。

圖3 獅子頭椒果實揮發物總離子圖Fig.3 The volatiles total ion of Zanthoxylum bungeanum Shizitou fruit

2.23種品種花椒果實主要揮發物種類及相對含量的比較通過蟲害高發期3種品種花椒果實揮發物的GC-MS總離子圖，采用峰面積歸一化法求出揮發性物質中各組分的相對含量，利用氣相色譜質譜聯用儀和計算機聯機系統對各揮發物組分進行定性，結合相關資料人工檢索鑒定其化學組成。

3種品種花椒果實主要揮發物(相對含量>0.5%)的對比見表1。由表1可知，大紅袍椒、鳳椒和獅子頭椒果實揮發物中分別含有74、64和77種化學物質，主要為烯類、醇類、酯類、烷類和醛類化合物，此外，含有少量的酮類、萘類等化合物。

比較3種品種花椒果實的主要揮發性物質在化學組成和相對含量之間的差異發現，大紅袍椒、鳳椒和獅子頭椒果實的揮發物均以d-檸檬烯含量最多，且相對含量差異不大，由此推測d-檸檬烯可能是花椒果實揮發物的主要成分。大紅袍椒和獅子頭椒果實揮發物中含量其次均為月桂烯、檜烯和羅勒烯等；而鳳椒含量其次為乙酸芳樟酯、檜烯和Gamma-萜品醇，可見不同品種花椒果實在揮發物化學組分和相對含量上具有一定差異。3個品種花椒果實中相對含量大于0.5%的21種揮發性物質中，除d-檸檬烯和(±)-α-乙酸松油酯外，其他揮發物相對含量均差異顯著(P<0.05)。對比研究發現，大紅袍椒和獅子頭椒果實揮發物的組分和相對含量差異不大，但與鳳椒果實揮發物差異較大。由表1可知，胡椒酮為大紅袍椒果實揮發物的特有成分；2-甲基二十烷為鳳椒果實揮發物的特有成分；殺那脫為獅子頭椒果實揮發物的特有成分。右旋大根香葉烯和(R)-1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環己烯在大紅袍椒和鳳椒果實中均含有，但獅子頭椒果實中未檢測到這2種揮發性物質。鳳椒果實揮發物中月桂烯和羅勒烯的相對含量(7.47%、1.60%)顯著低于大紅袍椒(17.88%、11.57%)和獅子頭椒(19.60%、10.11%)，存在極顯著差異(P<0.01)；但乙酸芳樟酯和芳樟醇的相對含量(20.99%、4.91%)顯著高于大紅袍椒(0.48%、0.44%)和獅子頭椒(0.89%、0.45%)；存在極顯著差異(P<0.01)。

3 結論與討論

寄主植物揮發物作為昆蟲的信息素來源之一，在昆蟲的寄主選擇和行為定位中扮演著重要角色[21]，指引其寄主選擇、取食、交配、產卵等多種行為[22]。植物受蟲害后誘導產生的植物揮發物對昆蟲的行為具有一定的調控作用，使其對寄主植物的偏好或拒避程度加強[23]。郭丹丹等[24]對雙斑長跗螢葉甲的行為反應測定結果表明，棉花和玉米揮發物中的d-檸檬烯對雙斑長跗螢葉甲雄蟲具有顯著的引誘作用，該研究通過對花椒窄吉丁高發期3種不同品種的寄主果實揮發物進行提取與鑒定，結果發現d-檸檬烯的相對含量均最高，故而猜測花椒果實中d-檸檬烯很可能是造成花椒窄吉丁高發的主要揮發物之一。研究發現5%d-檸檬烯可溶液劑可明顯抑制柑橘全爪螨卵的孵化和滅殺幼螨、紅火蟻等害蟲[25-26]。此外，d-檸檬烯還具有良好的醫學研究價值，付柏婷等[27]研究發現d-檸檬烯可顯著保護衣霉素(Tm)誘導的胰腺MIN6細胞損傷。但d-檸檬烯對花椒窄吉丁是否具有引誘或驅避作用還需進一步進行野外大田試驗。

花椒窄吉丁入侵后對花椒揮發物成分影響的研究發現，乙酸芳樟酯在受害株各部位均有發現，但未在健康株中發現[28]，對花椒窄吉丁的田間誘捕研究發現，田間誘捕花椒窄吉丁的最好誘芯為乙酸芳樟酯+α-水芹烯+月桂烯+(1R)-(+)-檸檬烯+順-9-十六烯醛[10]。研究發現順-9-十六烯醛是多種昆蟲[29-32]的信息素成分，并已被成功研發成性誘劑，但順-9-十六烯醛是否是花椒窄吉丁的性信息素成分還有待通過生物學等活性測定方法繼續深入探討。該研究發現鳳椒果實揮發物中乙酸芳樟酯的相對含量顯著高于大紅袍椒和獅子頭椒，高出20～25倍；但大紅袍椒和獅子頭椒果實揮發物中月桂烯的相對含量均高出鳳椒2倍以上，由此猜測乙酸芳樟酯和月桂烯很可能是造成花椒窄吉丁高發的主要揮發性成分，故而推斷花椒窄吉丁對鳳椒的趨避程度高于大紅袍椒和獅子頭椒。特殊的綠葉氣體可作為利他素具有增強信息素的功能[33-36]，寄主植物揮發物往往對昆蟲釋放的信息素起廣泛的增效作用[37]，Grant等[38]對白蠟窄吉丁的野外誘捕研究發現在白蠟窄吉丁性信息素中加入3-己烯醇后對白蠟窄吉丁雄蟲具有顯著的引誘作用，該研究中檸檬烯、月桂烯和乙酸芳樟酯對花椒窄吉丁是否具有性信息素增效劑的作用尚不清楚，故期望在今后研究中能夠實現野外試驗驗證其對花椒窄吉丁信息素的響應機制。

固相微萃取/氣相色譜/質譜(SPME/GC/MS)聯用技術是常用的植物揮發物提取方法，具有高效率、操作簡便等優勢，史睿杰等[39]采用固相微萃取/氣相色譜/質譜(SPME/GC/MS)聯用技術成功分析了青海云杉枝條和針葉中的揮發性化合物，并鑒定出65種化學成分。該研究利用固相微萃取/氣相色譜/質譜(SPME/GC/MS)聯用技術分析和鑒定3種品種花椒果實揮發物成分，發現胡椒酮為大紅袍椒果實揮發物的特有成分；2-甲基二十烷為鳳椒果實揮發物的特有成分；殺那脫為獅子頭椒果實揮發物的特有成分。胡椒酮已被證實為對玉米象有顯著的引誘作用[40]，2-甲基二十烷已被證實為木麻蛾(LymantriaxylinaSwinhoe)的性信息素成分[41]，殺那脫又名敵稻瘟，被證實為一種殺菌劑，能抑制孢子發芽，此外，殺那脫還對昆蟲具有強烈的毒殺和抑制作用[42]。胡椒酮、2-甲基二十烷和殺那脫能否作為花椒窄吉丁的信息素增效劑仍需進一步野外大田試驗驗證。對比研究花椒窄吉丁高發期不同品種寄主果實揮發物，可篩選出不同品種花椒果實特有的揮發性氣味物質，故而猜測花椒窄吉丁對不同品種寄主的趨向性或趨避性可能與寄主植物特有的揮發性物質有關。

表1 花椒窄吉丁蟲害高發期不同品種花椒果實揮發物成分及相對含量的比較

注：“—”表示含有該物質但相對含量不足0.5%，“— —”未檢測到。相對含量低于0.5%的成分且3種樣品中同時出現的揮發性微量組分表格中未予列出。同行數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: "—" means it contains the substance but the relative content is less than 0.5%, "— —" is not detected. The components with relative content less than 0.5% and volatile trace components occurring simultaneously in the three samples are not listed. The value in the table is the average value of 3 replicates, and different lowercase letters in the same line mean significant differences (P<0.05)

植物揮發物是指引植食性昆蟲寄主定向行為的主要因素[43]，對寄主植物花椒健康株和受害株的嫩枝、葉、韌皮部揮發物研究發現，花椒葉片中分離鑒定出56種揮發性成分，主要為羅勒烯、石竹烯和α-蒎烯；嫩枝中分離鑒定出57種揮發性成分，主要為石竹烯、蓽澄茄油烯、乙酸香葉酯和α-蒎烯；韌皮部中分離鑒定出38種揮發性成分，主要為石竹烯、α-蒎烯、律草烯和月桂烯[44]。非寄主植物揮發物對昆蟲的行為也具有一定的調控作用，研究發現非寄主植物冷杉揮發物對云杉八齒小蠹有驅避作用[45]。植食性昆蟲對不同濃度同種植物揮發物表現出不同的生理活性，存在一個最佳的劑量范圍[46]，對褐飛虱非寄主植物水稻揮發物研究發現，褐飛虱雌成蟲對不同含量水稻揮發物芳樟醇的選擇行為存在一定差異，含量1 μL的芳樟醇對褐飛虱具有顯著引誘作用，含量10 μL以上時則表現為拒避作用，含量15 μL以上時則具有極顯著的拒避作用。該研究僅提取并分析鑒定了花椒窄吉丁主要的3種品種寄主植物果實揮發物，而對花椒窄吉丁其他品種寄主植物揮發物和非寄主植物揮發物沒有研究，Andersson等[47]研究發現歐洲云杉八齒小蠹對寄主植物和非寄主植物的揮發物都有顯著反應，云杉八齒小蠹為害后自身產生的一種信息素物質可大量吸引云杉八齒小蠹，這種信息素物質已被證實為歐洲云杉八齒小蠹聚集信息素的一種。期望在今后對花椒窄吉丁的研究中也能夠實現對其非寄主植物揮發物的成分和相對含量分析，以豐富花椒窄吉丁生物防控信息素種類。該研究對篩選出的揮發性化合物并未進行野外大田試驗驗證，期望在今后的研究中能夠實現對花椒窄吉丁進行野外試驗驗證，從而篩選出最佳復配化合物誘芯，為進一步揭示花椒窄吉丁寄主侵害機理提供理論依據，為篩選和制備花椒窄吉丁生物防控引誘劑和驅避劑提供理論和技術支撐。