基于響應面法優化洋蔥豆漿酒發酵工藝

孫琪，王琪，劉琨毅，*，趙金松，夏熙洋

（1.宜賓職業技術學院五糧液技術學院，四川宜賓644003；2.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；3.宜賓市三中，四川宜賓644000）

目前，市面上大部分的乳酒都是以馬奶或羊奶為原料，以開菲爾粒或酵母菌與乳酸菌的混合菌為發酵劑，但存在酸度普遍偏高的不良特性[1-8]。利用大豆制得的豆漿與馬奶或羊奶相比，含有較為豐富的植物蛋白質及營養物質，是馬奶或羊奶理想的替代品，也是近年來研究的熱點[9-11]。豆漿酒作為一種含有酒精的復合飲料，與傳統的乳酒相比，其特點是含有豐富的植物蛋白和豆乳的其他營養成分，既補充了我國居民因牛乳等動物蛋白攝入不足的缺陷，又比傳統的乳酒口感更加柔和[12-14]。雖然豆漿酒酒體風味獨特、口感柔和，但是其中的豆腥味始終不能很好地去除進而影響豆漿酒整體的感官特性[14-15]。

復合型發酵酒是使用兩種或兩種以上的釀酒原料發酵而成的酒品，其能綜合兩種或兩種以上原料的特點與優勢，彌補利用單一原料釀酒在色、香、味上的欠缺和營養成分不足等缺陷[16]。洋蔥是藥食兩用的蔬菜，具有去腥增香的作用且富含多種營養物質，如含硫化合物、維生素、類黃酮、花色苷、甾體化合物、前列腺素A 等，因而使其具有抑菌抗氧化、降低心血管發病率、緩解糖尿病癥等保健功能[17-21]。因此，本試驗通過洋蔥汁與豆漿混合發酵釀造，以期釀出的酒體風味突出、口感幼滑、酸度適中且具有一定功效的豆漿酒，為工業化生產提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；大豆、洋蔥、白砂糖：宜賓大潤發超市；冰乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、氫氧化鈉：均為分析純，湖北鑫潤德化工有限公司；亞硫酸鈉（分析純）：南京試劑有限公司；硫酸銅（分析純）、酒石酸鉀鈉（分析純）：無錫市亞泰聯合化工有限公司；次甲基藍：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

JYL-C91T 型豆漿機：九陽股份有限公司；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；FA20043型電子天平：上海越平科學儀器有限公司；LXJ-IIB 低速大容量多管離心機：鄭州長城工貿有限公司；MCGNP-9080 系列隔水式恒溫培養箱：青島明成環保科技有限公司；DSX-280A 型不銹鋼手提式滅菌器：上海申安醫療器械廠；BCD-2HBSA 型電冰箱：青島海爾股分有限公司；PHs-3c 型精密pH 計：上海理達儀器廠；Alcomat Super 酒精度測試儀：意大利蓋博分析儀器公司。

1.3 洋蔥豆漿酒釀造工藝流程

操作要點：挑選顆粒成熟飽滿的大豆，去除其中的雜質，清水洗凈后用5 倍質量的清水浸泡9 h～12 h；將浸泡好的大豆按1∶10 的質量比加水磨漿后根據單因素試驗及響應面試驗的條件添加洋蔥汁及不同濃度的白砂糖，用檸檬酸溶液調pH值到5.0 后添加0.02%的亞硫酸鈉，以抑制雜菌的生長；在無菌條件下接入一定量的經活化后的酵母菌懸液，25 ℃發酵，待發酵完成后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。

1.4 試驗方法

1.4.1 理化指標測定方法

總糖（以葡萄糖計）測定：斐林試劑法[22]；酒精體積分數測定：密度瓶法[22]；總酸測定：電位滴定法[22]；氨基酸態氮測定：甲醛滴定法[22]。

1.4.2 感官評價

感官評價在學院食品品評室內完成，邀請13 位教師及實驗員組成評定小組，明確感官評定的指標和注意事項。參照符楨華、周傳云等人對豆漿酒的研究方法[13-14]及標準GB/T 23546-2009《奶酒》[22]對洋蔥豆漿酒從色澤（滿分5 分）、組織形態（滿分5 分）、香氣（滿分30 分）、滋味（滿分40 分）、典型性（滿分20 分）5 個方面制定洋蔥豆漿酒感官評價標準，如表1所示。

表1 洋蔥豆漿酒評分細則Table 1 Scoring rubric of onion soymilk liquor

1.4.3 洋蔥豆漿酒發酵工藝條件的單因素試驗

1.4.3.1 白砂糖添加量對洋蔥豆漿酒發酵效果的影響

在豆漿中加入4%的洋蔥汁后煮沸，分別加入8%、10 %、12 %、14 %、16 %的白砂糖及0.02 %的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.2%的酵母菌，25 ℃發酵5 d 后分別記錄洋蔥豆漿酒的感官特征，以確定較佳的白砂糖添加量。

1.4.3.2 洋蔥汁添加量對洋蔥豆漿酒發酵效果的影響

將洋蔥汁分別按照0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的百分比添加到豆漿中煮沸，并添加12%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.2%的酵母菌，25 ℃發酵5 d 后進行感官評價，以確定較佳的洋蔥汁添加量。

1.4.3.3 接種量對洋蔥豆漿酒發酵效果的影響

將洋蔥汁分別按照4%的添加量加入到豆漿中煮沸，并添加12%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后分別接入0.10 %、0.15 %、0.20 %、0.25 %、0.30 %的酵母菌，25 ℃發酵5 d 后分別進行感官評價，以確定較佳的酵母菌接種量。

1.4.3.4 發酵時間對洋蔥豆漿酒發酵效果的影響

將洋蔥汁分別按照4 %的添加量加入到豆漿中煮沸，并添加12%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.2%的酵母菌，在25 ℃的條件下分別發酵3、4、5、6、7 d 并進行感官評價，以確定較佳的發酵時間。

1.4.4 洋蔥豆漿酒發酵工藝條件的響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnken[23]的中心組合試驗設計原理，進行四因素三水平的響應面分析試驗，確定洋蔥豆漿酒最佳的釀造工藝條件，因素水平如表2所示。

表2 響應面試驗因素水平Table 2 Level and code of independent variable used for response surface analysis

1.5 數據分析處理方法

以上每個試驗重復3 次，結果取平均值。采用OriginPro 9.1 軟件進行數據制圖和統計分析。Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 白砂糖添加量對洋蔥豆漿酒感官評分的影響

控制處理條件為洋蔥汁添加量4%、接種量0.20%、發酵時間5 d，考察在白砂糖添加量分別為8%、10%、12%、14%、16%時洋蔥豆漿酒的感官評分，結果見圖1。

圖1 白砂糖添加量對洋蔥豆漿酒感官評分的影響Fig.1 Effect of sugar addition on sensory evaluation of onion soymilk liquor

由圖1可知，當洋蔥豆漿酒中白砂糖添加量從8 %增加到12%，洋蔥豆漿酒的感官評分也隨之增加；當添加量達到12%時，洋蔥豆漿酒的感官評分達到最高分（74.82±0.83）分。但隨著白砂糖添加量的繼續增加，洋蔥豆漿酒的感官評分開始呈現出逐漸下降的趨勢。糖分在洋蔥豆漿酒發酵過程中主要轉化為乙醇，也可以轉化成酸類、酯類、醛類等物質[14]，洋蔥豆漿酒在發酵過程中，可發酵性糖偏少會出現酒體不豐滿、香味不足的現象，可發酵性糖過多則會造成酒體酸度偏大等不良現象。故選用白砂糖添加量為10%、12%及14%用于后續響應面法試驗。

2.1.2 洋蔥汁添加量對洋蔥豆漿酒感官評分的影響

洋蔥汁添加量對洋蔥豆漿酒感官評分的影響見圖2。

圖2 洋蔥汁添加量對洋蔥豆漿酒感官評分的影響Fig.2 Effect of onion juice addition on sensory evaluation of onion soymilk liquor

由圖2可知，洋蔥汁能顯著改善豆漿酒的風味特征，不僅能有效去除豆漿酒中的豆腥味，而且能賦予豆漿酒獨特的風味。洋蔥豆漿酒的感官評分隨著洋蔥汁添加量的增加而呈現出先增高后降低的趨勢，當洋蔥汁添加量為4%時，洋蔥豆漿酒的感官評分達到最高的（74.82±0.83）分。因洋蔥汁含有大量的合丙烷硫醛和硫氧化物等物質，故使其具有較強的辛辣味[17]，洋蔥汁加入量過大會導致洋蔥豆漿酒呈現出較強的刺激性及辛辣感，因此當洋蔥汁添加量適當時才能賦予洋蔥豆漿酒特殊的風味。由此選擇3%、4%、5%的洋蔥汁添加量用于響應面優化試驗。

2.1.3 接種量對洋蔥豆漿酒感官評分的影響

接種量對洋蔥豆漿酒感官評分的影響見圖3。

圖3 接種量對洋蔥豆漿酒感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculums concentration on sensory evaluation of onion soymilk liquor

由圖3可知，隨著酵母菌接種量的不斷增加，洋蔥豆漿酒的感官評分也隨之不斷增加。當酵母菌接種量為0.30%時，洋蔥豆漿酒的感官評分達到最高的（76.24±1.01）分。酵母菌在發酵過程中能將可發酵性糖轉化為二氧化碳和乙醇，同時還會產生其它一些醇、醛、酸、酯等香味物質[13]。當酵母菌接種量偏低時，容易使釀酒原料不能完全發酵，造成洋蔥豆漿發酵酒度偏低、酒香不突出等現象。當酵母菌的接種量為0.25%時，其洋蔥豆漿酒的感官評分雖然較酵母菌接種量為0.30%時低，但兩者并無顯著性差異（p＞0.05）。所以選擇酵母菌接種量為0.20%～0.30%用于響應面法試驗。

2.1.4 發酵時間對洋蔥豆漿酒感官評分的影響

控制處理條件白砂糖添加量12%、洋蔥汁添加量4%、接種量0.20%，分別考察發酵時間為3、4、5、6、7 d時洋蔥豆漿酒的感官評分，結果見圖4。

由圖4可知，當洋蔥豆漿酒的發酵時間為4 d 時，洋蔥豆漿酒的感官評分最高為（78.50±0.72）分。當發酵時間短于4 d 時，可發酵性糖類還未完全被酵母菌所利用，酒體略顯寡淡，香味不濃郁。當發酵時間長于4 d時，酒體產生了不良氣味，破壞了酒汁的風味，其原因可能是洋蔥汁在長時間發酵過程中，其中的含硫化合物被分解代謝后產生了一些不愉悅的氣味[18]。表明在白砂糖添加量12%、洋蔥汁添加量4%、接種量0.20%的條件下，洋蔥豆漿酒的最佳發酵時間在4 d 左右。因此選擇發酵時間為3 d～5 d 用于后續試驗。

圖4 發酵時間對洋蔥豆漿酒感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of onion soymilk liquor

2.2 響應面法試驗

根據Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理，通過Design Expert 8.0.6 軟件設計響應面法試驗，對白砂糖添加量、洋蔥汁添加量、接種量、發酵時間4 個因素分析得到以下試驗方案及結果，見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

續表3 響應面試驗設計及結果Continue table 3 Experimental design and results for response surface analysis

再通過Design-Expert 8.0.6 軟件對響應面法試驗得到的感官評分（表3）進行方差分析，得到結果如表4所示。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

由表4可知，4 個因素對洋蔥豆漿酒感官評分影響的強弱順序依次為：發酵時間＞白砂糖添加量＞洋蔥汁添加量＞接種量，其中發酵時間對洋蔥豆漿酒感官評分的影響顯著（p＜0.05）。白砂糖添加量與發酵時間之間具有顯著的交互作用（p＜0.05）。設白砂糖添加量、洋蔥汁添加量、接種量、發酵時間分別為A、B、C、D，以洋蔥豆漿酒的感官評分為響應值，經多元回歸擬合后，得到洋蔥豆漿酒感官評分回歸方程：洋蔥豆漿酒感官評分=85.70+0.92A-0.90B+0.12C-1.58D+0.89AB+0.89AC-2.42AD-0.58BC-0.56BD-1.05CD-2.82A2-0.98B2-1.84C2-2.84D2

根據表4 中方差分析結果，洋蔥豆漿酒感官評分的回歸方程描述與響應面值之間的關系模型顯著（p＜0.05），且失擬項檢驗不顯著（p＞0.05），表明未知因素對試驗結果的干擾較小，該試驗模型充分擬合試驗數據，洋蔥豆漿酒感官評分的回歸方程是洋蔥豆漿酒感官評分與洋蔥豆漿酒發酵工藝各參數的合適數學模型，即可以利用此回歸方程確定洋蔥豆漿酒釀造的最佳工藝[24]。

響應面圖形是響應值對各試驗因子所構成的三維空間的曲面圖，從響應面分析圖上可形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用[25]。根據洋蔥豆漿酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應面分析圖結果見圖5。

圖5 兩因素交互作用對感官評分的響應面圖Fig.5 Response surface plots for the effect of operating parameters on the sensory evaluation

由響應面圖曲面坡度越陡峭、等高線越密集成橢圓形表示兩因素交互影響越大的原則[24-26]可知，因子A（白砂糖添加量）與因子D（發酵時間）之間所形成的響應面曲面坡度在兩因素交互作用響應面圖中最為陡峭，即因子A與因子D相互之間具有最強的交互作用。該結果與表4 方差分析所得的白砂糖添加量與發酵時間之間具有顯著的交互作用（p＜0.05）的結論相吻合。

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析確定洋蔥豆漿酒的最佳發酵工藝條件為白砂糖添加量12.94%、洋蔥汁添加量3.81%、接種量0.27%及發酵時間3.49 d，此條件下由公式算出的理論值為86.32 分。根據所得的分析數據進行3 組驗證試驗，驗證試驗的條件為白砂糖添加量12.9%、洋蔥汁添加量3.8%、接種量0.27%及發酵時間3.5 d，得到洋蔥豆漿酒的感官評分為（86.78±1.04）分，測定結果穩定，偏差不大，證明該結果合理可靠。

2.3 理化指標分析

經測得洋蔥豆漿酒在最佳發酵工藝條件下的總糖為13.1 g/L、酒精度4.5 %vol、總酸7.6 g/L、氨基酸態氮0.12 g/L。4種理化指標均符合中華人民共和國GB/T 23546-2009《奶酒》標準[22]。

3 結論

在單因素試驗的基礎上采用響應面法對洋蔥豆漿酒的發酵工藝條件進行了優化，影響洋蔥豆漿酒感官評分的工藝因素按主次順序排列為發酵時間＞白砂糖添加量＞洋蔥汁添加量＞接種量。最終確定了其最優工藝條件為：將浸泡好的大豆按1∶10 的質量比加水磨漿后添加3.8%的洋蔥汁，并加入12.9%的白砂糖，用檸檬酸溶液調pH值到5.0 后添加0.02%的亞硫酸鈉，在無菌環境條件下接入0.27%經活化后的酵母菌懸液，在25 ℃條件下發酵3.5 d 后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。此條件下可獲得色澤微黃、透明，豆香、蔥香與酒香和諧、酒體圓潤的洋蔥豆漿酒，其感官評分為86.78 分。