翡翠貽貝副肌球蛋白的特性及在模擬胃腸液中的消化

鄒 睿，張凌晶,2，鐘 嬋，翁 凌,2，林麗云，李鈺金，劉光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建 廈門 361021；3.泰祥集團 山東省海洋食品營養研究院，山東 榮成 264309）

貽貝屬于雙殼類海洋軟體動物、瓣鰓綱、貽貝科，有較高的營養價值和一定的藥用價值。近年來，我國貽貝產量不斷增長，2016年已達87.9萬 t[1]，尤其在山東、浙江、福建等沿海省份，貽貝已成為一種重要的經濟貝類。

貝類肌肉中存在的副肌球蛋白（paramyosin，PM）是一種較為特殊的肌原纖維蛋白，常見于無脊椎動物中，在脊索動物中較為罕見[2]。研究表明，PM位于無脊椎動物粗肌絲的核心組成部分，與粗肌絲的伸縮運動有關，是一種重要結構蛋白[3-5]。無脊椎動物肌肉中PM含量的高低會顯著影響其質構。有研究報道，在蝦夷扇貝閉殼肌中，PM含量高的平滑肌質地更加脆硬[6]。

近年研究發現，諸如血吸蟲、塵螨等多種寄生蟲PM具有顯著抗原特性，能夠在人及牲畜體內引起較強的過敏反應[7-9]。Suzuki等[10]通過血清學實驗也證實在軟體動物中，除原肌球蛋白（tropomyosin，TM）外，PM也是一種主要的過敏原，且兩者之間存在IgE交叉反應性。

貝類肌肉中PM豐度高，在肌原纖維中的相對含量可達20%～40%[11]，但目前國內外對其研究仍較少。前期研究對來源于皺紋盤鮑的PM進行分離純化并對其生物化學性質進行探討[12]。本研究擬以我國高產的翡翠貽貝為研究對象，從其肌肉中分離純化PM，并對PM在模擬胃腸液中的消化穩定性進行分析，以期為貝類深加工以及PM的后續研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活翡翠貽貝（每只帶殼均質量（35±5）g）購買于廈門集美菜市場，放置冰盒內帶回實驗室，在4 ℃冷庫內開殼后取其肌肉置于冰上，并于2 h內用于實驗。

預染標準分子蛋白 美國New England Biolabs公司；豬胃蛋白酶（酶活力250 U/mg）、牛胰凝乳蛋白酶（酶活力40 U/mg） 美國Sigma公司；豬胰蛋白酶（酶活力250 U/mg） 上海麥克林生化科技有限公司；Protein A Sepharose 美國GE Healthcare公司；5 mL羥基磷灰石預裝柱 美國Bio-Rad公司；HRP標記的羊抗兔IgG美國Pierce公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PT 2500 E組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；Avanti JA-25高速冷凍離心機 美國Beckman公司；G-BOX凝膠成像儀 英國Syngene公司；Fluor Chem Q化學發光成像儀 法國Alpha Innotech公司；Chirascan圓二色譜儀 英國Applied Photophysics公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白含量的測定

利用微量蛋白核酸測定儀對層析過程中樣品的吸光度A220nm及A280nm進行測定。參照Bradford等[13]方法對用于模擬胃腸液消化實驗的蛋白進行定量測定，并對樣品蛋白濃度作適當調整。將40 μL樣品與2 mL考馬斯亮藍G-250染料室溫反應5 min后，測定其在595 nm波長處的吸光度，以牛血清白蛋白為標準蛋白建立標準曲線，每組實驗重復測定3 次。

1.3.2 樣品的制備與純化

肌原纖維的提取參照Cao Minjie等[14]的方法，其他純化步驟主要參考Suzuki等[10]方法，并作適當調整。將新鮮貽貝肌肉切碎后稱質量，加入料液比1∶10（g/mL）的冰冷緩沖液A（10 mmol/L磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），含0.5 mmol/L L-半胱氨酸和0.15 mol/L NaCl，pH 6.8），搗碎。4 ℃、8 000×g離心10 min，棄去上清液，取沉淀，重復此操作5～6 次。最后一次獲得的沉淀中加適量緩沖液B（10 mmol/L PBS，含0.5 mol/L NaCl和0.1% β-巰基乙醇，pH 6.8）充分溶解后，4 ℃、12 000×g離心20 min，收集上清液，即得到肌原纖維蛋白。在上清液中加入MgCl2至終濃度1.5 mmol/L，4 ℃攪拌12 h后20 000×g離心30 min。收集上清液，進行15%～25%硫酸銨鹽析，所得沉淀加適量緩沖液B溶解后并充分透析于緩沖液B。樣品經0.22 μm濾膜過濾后上樣于羥基磷灰石層析柱，用緩沖液B對未吸附部分進行流洗，吸附部分蛋白用10～200 mmol/L的緩沖液（含0.5 mol/L NaCl和0.1% β-巰基乙醇，pH 6.8）進行線性洗脫，最終得到純化的PM。

1.3.3 質譜鑒定

將純化的PM進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），考馬斯亮藍染色后對目標蛋白進行切膠回收，并用胰蛋白酶進行酶解，將酶解片段進行串聯飛行時間質譜分析，一級質譜掃描范圍為800～4 000 Da。在一級質譜結果中選擇信噪比大于50的肽段進行二級質譜分析，所得數據于NCBInr數據庫進行肽段序列檢索。質譜鑒定過程委托上海生命科學研究院蛋白質組研究分析中心完成。

1.3.4 兔抗PM多克隆抗體的制備

制備抗體的PM來源于皺紋盤鮑，參考游銀川等[12]方法從皺紋盤鮑肌肉中獲得純化的PM，并免疫新西蘭大白兔制備兔抗PM多克隆抗體。將1 mg/mL純化PM與等體積的弗氏完全佐劑充分混合后對成年新西蘭雄兔進行皮下注射，完成初次免疫。間隔2 周后將PM與等體積弗氏不完全佐劑充分混合并對兔進行加強免疫。加強免疫3 次后，取少量兔耳動脈血清檢測其效價及特異性，指標達到要求后進行頸動脈取血。取得的血液在4 ℃靜置4 h后，4 ℃、8 000×g離心15 min，收集血清。免疫過程委托廈門大學藥學院實驗動物中心完成。

利用Protein A Sepharose親和層析柱對血清中的IgG抗體進行純化。將血清與0.1 mol/L三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸（tris(hydroxymethel) aminomethane-HCl，Tris-HCl，pH 8.0）緩沖液等體積混合后上樣于Protein A Sepharose親和層析柱，依次用0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液和10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液對未吸附部分進行流洗，吸附部分用0.1 mol/L甘氨酸-HCl（pH 3.0）緩沖液進行洗脫并收集，立即用0.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）中和，最終得到純化的兔抗PM多克隆抗體。

1.3.5 PM的熱變性溫度及熱穩定性分析

以梯度降低透析外液濃度的方式對純化PM進行脫鹽，最終將樣品以超純水充分透析。利用圓二色譜測定PM的熱變性溫度，以超純水作為空白對照。掃描波長范圍為185～260 nm，掃描溫度為20～90 ℃。

通過水浴加熱的方式對純化PM的熱穩定性進行分析。在500 μL離心管中加入等量PM，將樣品分別置于30～100 ℃水浴鍋中加熱30 min，加熱完畢后立即冷卻至室溫。以體積比3∶1向樣品中加入4×SDS緩沖液，95 ℃加熱10 min完成SDS化，低速離心后取上清液進行SDSPAGE分析。

1.3.6 PM的pH值穩定性分析

先配制一系列相同濃度（0.2 mol/L）、不同pH值（3～11）的緩沖液（含0.5 mol/L NaCl和0.1% β-巰基乙醇），再取等量的PM分別加入到不同pH值的緩沖液中，充分混勻后置于4 ℃孵育1 h。結束后立即95 ℃加熱10 min完成SDS化，低速離心后取上清液進行SDS-PAGE分析。

1.3.7 貽貝肌肉蛋白的模擬胃腸液總消化

參照美國藥典[15]的方法配制模擬胃、腸液，對貽貝肌肉蛋白進行體外模擬胃腸液總消化實驗，參考萬楚君等[16]方法，并在其基礎上適當調整。新鮮貽貝肌肉經100 ℃加熱10 min后切碎，以料液比1∶10（g/mL）加入0.25 mol/L NaCl溶液進行組織搗碎，后置于冰上間歇20 s，重復此操作4～5 次，直至肌肉被充分搗碎，Bradford法測得其質量濃度為8.5 mg/mL。所用消化酶分別為豬胃蛋白酶（250 U/mg）、豬胰蛋白酶（250 U/mg）及牛胰凝乳蛋白酶（40 U/mg），配制3 種酶使其質量濃度均為0.85 mg/mL。取300 μL肌肉勻漿樣品與等體積不含胃蛋白酶的模擬胃液（pH 1.2）混合，加入60 μL胃蛋白酶，37 ℃反應60 min后，加入25 μL 濃度為1 mol/L的NaOH溶液調節pH 7.5。此后，在樣品中加入60 μL胰蛋白酶并反應120 min，繼續加入60 μL胰凝乳蛋白酶再反應120 min，然后將樣品在95 ℃加熱5 min，終止反應。

1.3.8 PM的模擬胃液消化

對PM的消化穩定性分析主要參考Huang Yuanyuan等[17]的方法。模擬胃液消化過程中所用酶為胃蛋白酶，活力及用量與上述貽貝肌肉總蛋白消化一致。將200 μL PM樣品與200 μL不含胃蛋白酶的模擬胃液混勻后，加入40 μL胃蛋白酶，在37 ℃反應0、1、5、10、15、30、45、60 min時取出60 μL樣品，加入5 μL NaOH溶液（1 mol/L）終止反應，然后進行SDS-PAGE分析。對照組加入等量不含胃蛋白酶的模擬胃液。

1.3.9 PM的模擬腸液消化

分別用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對PM進行模擬腸液消化穩定性分析，反應體系與模擬胃液消化一致，酶與PM質量比均為1∶50，反應時間分別為0、5、15、30、60、120、180、240 min，對照組加入等量不含酶的模擬腸液。

1.4 數據處理

采用Excel 2007軟件對數據進行整理，Adobe Illustrator CS5軟件處理圖像。

2 結果與分析

2.1 PM分離純化結果

由圖1、2可知，貽貝肌原纖維蛋白中的PM經過飽和度15%～25%硫酸銨鹽析后得到富集，再經過羥基磷灰石柱層析后，目標蛋白在PBS濃度為0.15 mol/L左右時被洗脫下來，SDS-PAGE結果顯示為單一條帶，分子質量約為99.5 kDa。

圖1 翡翠貽貝PM的羥基磷灰石柱層析Fig. 1 Elution curve of PM from Perna viridis by hydroxyapatite chromatography

圖2 PM的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE profile of PM

2.2 質譜鑒定結果

將純化的PM經胰蛋白酶酶切后得到肽段的一級質譜圖，其中每個峰代表一個肽段（圖3）。將所得數據在NCBI上進行序列檢索，得到26 個肽段，共計330 個氨基酸殘基（表1）。

圖3 翡翠貽貝PM肽質量指紋一級質譜圖Fig. 3 PMF of purified PM digested by trypsin

如圖4所示，翡翠貽貝PM的肽段與地中海貽貝PM序列[18]的一致性為100%，與太平洋牡蠣[19]及盤鮑PM[20]序列一致性分別為77%和72%，表現出較高的同源性，證明純化的蛋白即為PM。分析地中海貽貝PM氨基酸組成時發現，其芳香族氨基酸含量極低，其中色氨酸（W）數量為1，酪氨酸（Y）數量為14，苯丙氨酸（F）數量為5，該蛋白在280 nm波長處的吸光度低。這也是在純化PM時需在220 nm波長處進行蛋白檢測的原因。

圖4 翡翠貽貝PM與盤鮑（Haliotis discus discus）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）以及地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis）PM的序列比對Fig. 4 Peptide alignment of PM from Perna viridis with those from Haliotis discus discus, Crassostrea gigas and Mytilus galloprovincialis

表1 翡翠貽貝PM質譜所得肽段序列Table 1 Peptide sequences of PM

續表1

2.3 PM的二級結構及變性溫度分析

圖5 加熱對PM二級結構的影響（A）及其熱變性溫度（B）Fig. 5 Effects of temperature on secondary structure of PM (A) and its thermal denaturation temperature (B)

由圖5可知，PM呈現典型的α-螺旋結構。加熱會導致其正、負吸收峰值減少，溫度回復之后其吸收峰值基本恢復至原值，表明在該加熱過程中，其二級結構的變化是可逆的（圖5A）。其熱變性溫度為（56.3±0.2）℃（圖5B）。

2.4 PM的熱穩定性及pH值穩定性分析

將貽貝PM經過30～100 ℃熱處理30 min，低速離心后，對其上清液進行SDS-PAGE分析，由圖6可知，蛋白條帶濃度并沒有發生明顯變化，表明PM的熱穩定性良好。

圖6 PM的熱穩定性分析Fig. 6 Thermostability of PM

由圖7可知，PM在pH值為6～11范圍內均能夠保持較好的穩定性。但當pH值為5時，PM出現部分聚集沉淀現象，pH值低至3～4時，聚集沉淀現象更為明顯，低速離心后上清液中的蛋白量明顯減少，說明PM在中性條件下穩定性良好，但在酸性條件下不穩定。

圖7 PM在不同pH值的穩定性分析Fig. 7 pH stability of PM

2.5 貽貝肌肉蛋白的模擬胃腸液總消化結果

圖8 貽貝肌肉蛋白模擬胃腸液消化的SDS-PAGE（A）和Western blot分析（B）結果Fig. 8 SDS-PAGE (A) and Western blot analysis (B) of simulated gastrointestinal digests of Perna viridis muscle proteins

從圖8可以看出，貽貝肌肉蛋白經過不同的酶消化后，均發生不同程度的降解。經過胃蛋白酶消化后，大部分蛋白都已被降解，但分子質量在30～130 kDa的降解片段依然存在。經過胰蛋白酶消化后，絕大部分蛋白被降解成小分子片段。經胰凝乳蛋白酶消化后，這些片段被進一步降解，但最后仍有分子質量為30 kDa左右的部分小片段未被完全消化。利用兔抗皺紋盤鮑PM多克隆抗體對各階段的消化產物進行Western blot分析發現，這些未降解的條帶均來源于PM。

2.6 模擬胃液和腸液消化穩定性分析

圖9 PM模擬胃、腸液消化的SDS-PAGE分析Fig. 9 SDS-PAGE analysis of simulated gastrointestinal digests of PM

由圖9a可知，PM原始片段在1 min之內就被胃蛋白酶全部降解成分子質量約為80 kDa的片段。隨著時間延長，該片段逐漸被降解成小分子片段。但在反應60 min后，80 kDa的片段仍沒有被全部降解，并且在70 kDa及55 kDa的位置產生較穩定的片段，表明PM是一種比較耐胃蛋白酶消化的蛋白。

與模擬胃液消化結果相比，在模擬腸液消化過程中，PM會被降解成更多更小的片段。從圖9b可以看出，PM的原始片段在短時間內就被胰蛋白酶全部降解，并且在55～72 kDa區間內產生降解片段。隨著時間的延長，這些片段也被進一步消化，但即便反應240 min后，PM依然未被完全消化，在分子質量約為52 kDa處產生一穩定的片段，而最小可見蛋白條帶的分子質量約為43 kDa。胰凝乳蛋白酶對PM的降解程度與胰蛋白酶較為相似，SDS-PAGE圖中最小可見蛋白條帶的分子質量約為45 kDa（圖9c），表明PM對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶也具有較高的耐受性。

3 討 論

貝類、頭足類等水產動物肌肉中的PM是一種典型的鹽溶性蛋白，只溶于高鹽緩沖液，在低鹽環境下易析出。周茹等[21]對秘魯魷魚肌原纖維蛋白的鹽離子濃度依賴性進行研究，結果顯示，當鹽濃度≤0.4 mol/L時，肌原纖維蛋白中的PM以及其他蛋白的溶解性會隨著鹽濃度的升高而增大；在0.4～0.8 mol/L內，隨著鹽濃度的上升，原肌球蛋白與肌球蛋白重鏈的相對含量均呈現逐漸上升的趨勢，而PM相對含量會略有減少。因此，為提高PM的純化效果，本研究在Suzuki等[10]純化PM的方法（PBS中的鹽濃度為0.9 mol/L）基礎上加以改進，將PBS鹽濃度調整為0.5 mol/L，在保證PM有較高的溶解性的同時避免過多鹽溶性雜蛋白的融入。

Suzuki等[10]對6 種軟體動物肌肉的鹽溶性蛋白進行100 ℃熱抽提10 min后，發現PM含量大幅減少，而TM無明顯變化，因此認為，PM熱穩定性較TM差，會因熱變性而形成沉淀。Zhu Beiwei等[22]在研究加熱對鮑魚肌肉質構和顯微結構的影響研究中也發現，當溫度升至50 ℃時，肌肉中PM含量隨著溫度的上升逐漸減少。而本研究對純化翡翠貽貝PM的熱穩定性分析結果顯示，PM經過100 ℃加熱30 min后并沒有沉淀產生。圓二色譜分析也顯示雖然在高溫下PM的二級結構發生明顯改變，但溫度恢復后，其結構也隨之恢復（圖5），這表明在低于100 ℃的條件下，PM的二級結構變化是可逆的，該蛋白是一種耐熱蛋白。實際上，PM是一種肌球蛋白結合型蛋白[23-25]，而肌球蛋白對熱非常不穩定，這也解釋了為何肌肉蛋白抽提液中的PM會因為加熱而變性沉淀，但純化PM對熱穩定。

分析PM在酸性環境下容易聚集沉淀的原因，是由于溶液pH值接近PM等電點，導致其分子所帶電荷減少，分子之間的排斥力減弱，從而聚集產生沉淀。游銀川等[12]利用雙向電泳測得皺紋盤鮑PM等電點為5.4，通過生物信息學分析獲得地中海貽貝（BAA36517.1，Mytilus galloprovincialis）PM等電點為5.0，這與本研究的結果相近。

對貽貝肌肉蛋白的模擬胃腸液總消化發現，經過胃蛋白酶消化后，肌肉中的主要結構蛋白（肌球蛋白重鏈、PM、肌動蛋白）均發生明顯的降解，并產生大量降解條帶。這些降解條帶繼而被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解成分子質量更小的片段，但在反應結束后依然有少量未被完全消化，免疫印跡檢測表明未消化的條帶均來源于PM。本研究室前期研究報道了生鮮、煮制、干制、罐制4 種加工方式制備的皺紋盤鮑肌肉經模擬胃腸液消化后，所有蛋白被完全降解[16]，與本研究結果有一定差異。除物種差異性外，分析原因可能是對鮑魚的研究中所使用的胰蛋白酶活力（325 U/mg）、胰凝乳蛋白酶活力（59.3 U/mg）及反應時間（4 h）均高于本研究，因此酶解程度較本研究會更徹底。

對PM的模擬胃、腸液消化穩定性分析結果顯示，PM在3 種酶的消化作用下分別呈現不同的降解趨勢，該結果與張凌晶等[26]報道的太平洋牡蠣肌原纖維蛋白的模擬胃、腸液消化過程中PM的降解趨勢較為相似。本研究中，胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶單獨消化均未能將PM完全降解。只有在3 種酶連續作用下其降解才較為有效，說明PM是貽貝肌肉中最難被消化的，這可能與PM穩定結構有關。圓二色譜（圖5）分析顯示PM的二級結構主要為α-螺旋，α-螺旋依靠氫鍵維持其穩定性。在組成蛋白質的氨基酸中，脯氨酸由于其亞氨基少一個氫原子，無法形成氫鍵，因此是α-螺旋結構的破壞者。分析地中海貽貝PM序列發現，該蛋白僅有1 個脯氨酸殘基，因此，非常有利于其形成穩定的α-螺旋結構。有研究指出，PM在天然狀態下由2 條單體互相纏繞形成雙螺旋結構[25]，這種二聚體形式也在一定程度上增加其對酶水解的抗拒性。但在胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶3 種酶的連續作用下，因為酶切位點的增加，與單一酶水解相比，效率大大增加。

已有研究表明，在軟體動物肌肉中，除主要過敏原TM外，PM也是一種過敏原。TM因其較高的熱穩定性以及耐消化性，在免疫學領域一直備受學者們的關注[27-29]。PM與TM盡管在分子質量和一級結構序列上有較大差異，它們具有相似的熱穩定性和pH值穩定性，還具有相似的IgE結合活性[10]、氨基酸組成[20,30]以及二級結構特征等[31-33]。因此，對貝類PM的研究有待進一步深入。