交叉等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)幽門螺桿菌方法的建立

劉文鑫 袁超文 王瑩瑩 馮瑜菲

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.Pylori）是一種全球最常見的寄生于人類胃黏膜的革蘭氏陰性微需氧菌，被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（WHO/IARC）定義為I類致癌因子，也是引起慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等疾病的主要因素[1-2]。在世界范圍內(nèi)大約50%以上的人口感染Hp，尤其在發(fā)展中國家和不發(fā)達(dá)國家地區(qū)感染率更高[3]，我國Hp的總感染率調(diào)查結(jié)果顯示，我國人群總感染率高達(dá)50% 左右，且流行發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)[4]。Hp的毒力因子主要包括細(xì)胞毒素相關(guān)基因（cagA）、空泡毒素基因（vacA）和尿素酶基因（ureA、ureB）和磷酸葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶基因（ureC）等，尿素酶基因?yàn)镠. pylori感染的首要因素，可通過定植胃黏膜上皮細(xì)胞并刺激分泌細(xì)胞因子誘發(fā)炎癥反應(yīng)[5]。目前，對(duì)于幽門螺桿菌的檢測(cè)手段主要包括侵入性檢測(cè)（內(nèi)鏡成像、病理組織學(xué)檢查、快速脲酶試驗(yàn)等）和非侵入性檢測(cè)（尿素呼氣試驗(yàn)、糞便抗原檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)等）[6]，但每種方法都存在著其各自的優(yōu)缺點(diǎn)和臨床應(yīng)用的限制，如快速尿素酶試驗(yàn)會(huì)對(duì)胃黏膜造成損傷，且不適用于凝血功能差或服用抗凝藥物的患者[7]。UBT 被認(rèn)為是目前診斷幽門螺桿菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但檢測(cè)耗時(shí)長、成本較高[8-9]。分子生物學(xué)（如real-time PCR法）可被用來快速檢測(cè)H. pylori，但其應(yīng)用大多需要昂貴儀器，限制了在基層醫(yī)院和防疫部門推廣。因此，快速、低廉、高效地檢測(cè)H. pylori感染對(duì)公共醫(yī)療事業(yè)具有重要意義。與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可通過具有鏈置換活性的聚合酶和特異性引物在恒定溫度下完成快速擴(kuò)增，因其操作簡便、快速準(zhǔn)確且無需昂貴設(shè)備儀器等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已被廣泛用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等方面[10-11]。本研究應(yīng)用一種新的交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Cross-priming amplification，CPA），針對(duì)幽門螺桿菌尿霉素B基因（UreB）設(shè)計(jì)特異性引物建立一種無創(chuàng)、高特異性和靈敏性的快速檢測(cè)方法，可為基層醫(yī)療單位和防疫部門提供操作更為簡單的快速診斷方法。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、試劑與儀器

DNA提取試劑盒（TAKARA）、dNTPs（TansGen）、甜菜堿（Sigma-Aldrich）、瓊脂糖（Wissen）、Bst DNA聚合酶（New England Biolabs）、反應(yīng)引物（上海生工生物工程公司合成）；電泳儀（北京六一）、凝膠成像系統(tǒng) 2500R （Tanon）、濁度儀（HACH）、臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf）、電熱恒溫水浴鍋（歐萊博 H-W420）。

菌株采用2株幽門螺桿菌及7株其他相關(guān)陰性菌：幽門螺桿菌ATCC 26695、ATCC 43504、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC 23715、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、大腸桿菌ATCC 43886、副溶血性弧菌ATCC 27519、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、腸出血性大腸桿菌ATCC 35150均為本研究室保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

以幽門螺桿菌的尿霉素B基因（UreB）序列（GenBank登錄號(hào)：AY714224.1）為靶基因，設(shè)計(jì)3套CPA特異性引物（分別命名為HCPA-1、HCPA-2和HCPA-3），序列見表1。

表1 幽門螺桿菌CPA擴(kuò)增引物

1.3 模板DNA的制備

使用DNA提取試劑盒提取幽門螺桿菌DNA基因組，具體方法見試劑盒說明書。

1.4 反應(yīng)的體系建立與優(yōu)化

首先對(duì)3套CPA特異性引物進(jìn)行驗(yàn)證，反應(yīng)體系25 μL包含：2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、20 mmol/L MgCl22.5 μL、10×bst Buffer 2.5 μL、0.8 mol/L Betaine 2 μL、8 U Bst DNA聚合酶、待測(cè)樣品基因組 DNA 2 μL。HCPA-1、HCPA-2和HCPA-3引物量分別為：F1為5 μL，F(xiàn)5F/F5B各2 μL，F(xiàn)3/B3各0.5 μL，以上引物濃度均為10 μM，并在60℃恒溫條件下每隔3 min取樣一次，連續(xù)孵育72 min，擴(kuò)增結(jié)果用濁度儀于650 nm處進(jìn)行測(cè)定。

為確定CPA最佳的反應(yīng)溫度、Bst DNA聚合酶濃度和反應(yīng)時(shí)間，每個(gè)反應(yīng)均需重復(fù)三次，選擇上述建立的擴(kuò)增最好的特異性引物分別對(duì)反應(yīng)溫度（60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃）、Bst DNA聚合酶濃度（6 U、8 U、10 U和12 U）、以及反應(yīng)時(shí)間（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min），反應(yīng)結(jié)果用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.5 特異性試驗(yàn)

本研究共使用9株實(shí)驗(yàn)菌（2株幽門螺桿菌和7株其他致病菌）進(jìn)行特異性檢測(cè)，同時(shí)設(shè)定不添加模板的陰性對(duì)照并與PCR法比較，擴(kuò)增產(chǎn)物均用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.6 靈敏度試驗(yàn)

取幽門螺桿ATCC 26695菌液1 mL進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，經(jīng)測(cè)得初始菌液濃度為1.26×108cfu/mL，PBS對(duì)菌液10倍倍比稀釋至1.26×102cfu/mL，隨后調(diào)整50 cfu/mL和25 cfu/mL共9個(gè)稀釋度。分別吸取2 μL稀釋后的菌液作為模板進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 臨床組織樣本檢驗(yàn)

對(duì)2017年7月—2018年6月收集的75例臨床胃黏膜組織樣本，進(jìn)行13C-尿素呼氣試驗(yàn)（13C-UBT）法檢測(cè)，其診斷結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)，隨后進(jìn)行CPA擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPA方法的建立與優(yōu)化

本研究設(shè)計(jì)的3套CPA特異性引物均具有良好的特異性，但HCPA-3的擴(kuò)增效果最佳，可在60℃條件下完成對(duì)UreB基因的大量擴(kuò)增（見圖1A）。隨后對(duì)HCPA-3特異性引物的反應(yīng)溫度、Bst DNA聚合酶濃度和擴(kuò)增時(shí)間分別進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：反應(yīng)溫度在62℃、Bst DNA聚合酶濃度為6 U、孵育時(shí)間于60 min時(shí)擴(kuò)增效率為最高（見圖1B-D）。

2.2 特異性試驗(yàn)

用上述優(yōu)化的CPA方法分別對(duì)9株不同的致病菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)，需重復(fù)三次。2%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，其中2株幽門螺桿菌擴(kuò)增結(jié)果均為陽性，其余7株陰性相關(guān)擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，且與PCR方法檢測(cè)結(jié)果相同，說明CPA法特異性較高，且對(duì)幽門螺桿菌檢測(cè)具有很好的通用性（見圖2）。

2.3 敏感性試驗(yàn)

將過夜培養(yǎng)的純菌液由1.26×108cfu/mL依次10倍稀釋至1.26×102cfu/mL，隨后稀釋50 cfu/mL和25 cfu/mL共9個(gè)稀釋度進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)果如圖3所示，CPA方法檢測(cè)的靈敏度達(dá)1.26×102cfu/mL。

2.4 臨床胃黏膜組織樣本檢測(cè)結(jié)果

對(duì)收集的75例臨床胃黏膜組織樣本進(jìn)行13C-尿素呼氣試驗(yàn)（13C-UBT）檢測(cè)作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，共檢測(cè)出H. pylori陽性27株，陽性檢出率為36.0%；而CPA法共檢測(cè)出H. pylori陽性26株，陽性檢出率為36.67%，檢測(cè)靈敏度達(dá)96.30%（26/27），且兩種方法的陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.53）。

3 討論

圖1 CPA特異性引物的篩選與優(yōu)化

圖 2 特異性試驗(yàn)

圖3 敏感性試驗(yàn)

幽門螺桿菌在全世界各地人群中感染率均較高，并與年齡、種族、性別和地理分布等因素密切相關(guān)，發(fā)展中國家的患病率高達(dá)50%～70%[12]，故研究者不斷開發(fā)各種診斷幽門螺桿菌的技術(shù)，以尋找一種快速、簡單、高特異性的診斷方法。傳統(tǒng)的H. pylori診完成對(duì)UreB基因的大量擴(kuò)增。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，HCPA-3特異性引物的通用性較好，不識(shí)別其他非幽門螺桿菌，但本研究選用的其他致病菌種類較少，導(dǎo)致特異性試驗(yàn)結(jié)果較為局限，應(yīng)在下一步的研究中加以完善。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CPA法的檢測(cè)極限為1.26×102cfu/mL，與之前報(bào)道的Realtime PCR方法的靈敏度相近，可滿足低濃度目的基因的檢測(cè)。通過對(duì)75例臨床胃黏膜組織樣本檢測(cè)，同“金標(biāo)準(zhǔn)”13C-尿素呼氣試驗(yàn)法檢測(cè)結(jié)果相符，其準(zhǔn)確率為96.30%（P＞0.05）且無假陽性出現(xiàn)。由此可見，CPA法檢測(cè)幽門螺桿菌的靈敏度和特異度均較高，能夠快速、準(zhǔn)確和高效的完成對(duì)H. pylori感染的診斷。

CPA法雖在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)設(shè)備的依賴性比PCR或real-time PCR法更為簡單，但在擴(kuò)增過程中會(huì)合成大量的DNA，形成的氣溶膠斷檢測(cè)主要以“金標(biāo)準(zhǔn)”UBT法為代表，但對(duì)于已接受胃鏡檢查的患者，再進(jìn)行UBT 檢測(cè)則增加了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。近年來，以PCR法為代表的分子生物學(xué)技術(shù)作為一種重要的基因診斷方法克服了操作繁瑣、耗時(shí)較長的缺點(diǎn)，并在許多領(lǐng)域得到了迅速的應(yīng)用與發(fā)展，Real-time PCR常被用于檢測(cè)組織樣本中DNA含量[13]，但該方法的開展需要專業(yè)操作人員和高昂的檢測(cè)設(shè)備，對(duì)很多條件簡陋的臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室來說這依舊是個(gè)難題。

CPA 是一種近年新出現(xiàn)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其原理與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）相似，現(xiàn)已成功應(yīng)用到多種細(xì)菌和病毒的核酸檢測(cè)當(dāng)中[14]。本研究針對(duì)幽門螺桿菌UreB基因設(shè)計(jì)特異性引物，并優(yōu)化反應(yīng)溫度、Bst DNA聚合酶濃度、反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)，成功建立了一種快速、簡單的新型檢測(cè)技術(shù)，從加樣到反應(yīng)結(jié)束整個(gè)過程可在1.5h內(nèi)易對(duì)周圍環(huán)境造成污染，所以在配置體系時(shí)應(yīng)防止DNA模板和反應(yīng)試劑污染，避免形成假陽性結(jié)果。向反應(yīng)體系內(nèi)加入核酸染料，利用顏色的變化判定檢測(cè)結(jié)果，但在反應(yīng)結(jié)束后開蓋一樣不能避免氣溶膠造成的污染，開發(fā)封閉防污染的試紙條雖然可以解決上述問題，但由于專利保護(hù)的限制，加大了開發(fā)的難度。因此，對(duì)于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)還應(yīng)不斷地探索與完善，尋找更多解決問題的方法。

綜上所述，本研究建立的CPA快速檢法，不僅具有時(shí)間短、低成本、檢測(cè)效率高的特點(diǎn)，且不需要依賴昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作條件，為基層醫(yī)院和防疫部門檢驗(yàn)幽門螺桿菌性感染提供一種新的思路。