胃萎縮性炎癥惡變過程中基因表達譜的變化

丁西平，毛玉娣，汪朝靚，周 歡，程 前

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，具有較高的發病率和死亡率[1]。早期胃癌無明顯的癥狀和體征，極大限制了早期的診斷率，并且錯過了治療的最佳時期，因此，目前胃癌的5年生存率仍然不令人滿意[2]。胃癌在病理特征上常繼發于慢性萎縮性胃炎和異型增生，其中包含眾多遺傳與表觀遺傳的改變，基因表達調控網絡復雜多元。例如，以往的研究[3]證明多種促炎基因之間相互作用參與胃癌的發生發展。為了提高胃癌早期診斷率，尋找新的臨床標志物和治療靶點，該文應用高通量基因芯片技術，研究胃萎縮性炎惡變過程基因表達譜的變化，并且通過生物信息學分析基因間的相互作用及所涉及的生物過程和信號通路。

1 材料與方法

1.1病例資料臨床標本的收集由中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。所有標本均來自中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)內鏡中心，包括5例慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生組織和5例進展期胃癌組織，并符合病理學診斷標準。兩組臨床標本均來自于男性患者，年齡分別為42～64(55±10.03)歲和45～65(57±9.14)歲(P=0.77)。所有胃癌患者均未接受任何治療包括手術、化療、放療以及生物治療等。內鏡下夾取的標本立即放入RNA later(美國Thermo Fisher公司)溶液中穩定RNA，防止降解，然后儲存于-80 ℃冰箱中。

1.2RNA提取與定量TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)用來提取各臨床標本中總RNA，并進一步采用 NucleoSpin? RNA clean-up試劑盒(740.948.250)對總RNA進行過柱純化。使用分光光度法(Nanodrop 2000，美國Thermo Scientific公司)檢測RNA的純度與總量，合格標準為吸光度A260/280≥1.80且RNA總量≥1 μg。瓊脂糖凝膠電泳用來檢測RNA完整性。

1.3基因芯片檢測提取各組織中的總RNA先合成cDNA，并在體外轉錄成cRNA，既而反轉錄合成cDNA, 經Nucleospin? Extract Ⅱ試劑盒(MN公司，Cat.No.740609.250)純化后使用紫外分光光度計定量，然后經熒光染料標記后與 mRNA 表達譜芯片V4.0(GeeDom)進行雜交?；蛐酒s交、清洗和掃描由北京博奧生物有限公司完成。

1.4GO富集和KEGG信號通路分析GO(Gene Ontology)富集分析包括細胞組分、分子功能和生物過程三個獨立的分析體系，可以整合生物信息學數據庫中的資源。 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 信號通路和GO分析用來探索差異性表達的基因參與的信號通路及生物過程。Cytoscape V3.2.1軟件用來解讀差異性基因相關的信號通路及功能，顯著性的檢驗水準為α=0.05。

1.5PPI(Protein-ProteinInteraction)網絡分析STRING數據庫是檢索基因間相互作用的搜索工具，可以提供實驗性和預測性的基因之間的相互作用和聯系。STRING 10.0版本用于繪制和分析差異性表達基因間的相互作用。

1.6統計學處理Agilent Feature Extraction軟件用于處理基因芯片掃描圖并得到原始數據，GeneSpring 軟件將原始數據進行歸一化分析并以Excel格式輸出數據。通過SPSS 17.0軟件進行雙樣本T檢驗，差異表達基因篩選標準為Fold Change(FC，變化倍數)≥2.0且P<0.05；Cluster 3.0軟件用于聚類分析，GraphPad Prism 6軟件用于圖形展示。

2 結果

2.1胃萎縮性炎癥惡變過程中基因表達譜的變化為了全面分析胃萎縮性炎惡變至胃癌過程中基因表達譜的變化，本研究收集了5例慢性重度萎縮胃炎伴腸上皮化生組織和5例進展期胃癌組織進行高通量基因芯片檢測。轉錄組基因芯片分析技術顯示了萎縮性胃炎組織及胃癌組織中基因表達譜的變化， 共2 779個具有明確注釋的基因差異性表達(FC>2且校正后P<0.05認為是具有顯著差異性表達)，與萎縮性胃炎組織相比，有1 288個基因在胃癌組織中高表達，1 491個基因在胃癌組織中低表達?；鹕綀D可以更加清晰的顯示差異性基因的表達情況，綠色表示在萎縮性胃炎組織中低表達的基因，紅色表示在萎縮性胃炎組織中高表達的基因，黑色標記的基因表示沒有顯著性變化的基因，但是它們的變化倍數可能很大，或者P值可能極小，見圖1。

圖1 全部檢測基因火山圖差異比較

以變化倍數(fold change ,FC)的log2為橫軸，以校正后P值的lg值負數為縱軸，繪制火山圖，分析全部檢測基因的差異；圖中灰色橫線是校正后P值=0.05的位置，兩條灰色的豎線是FC=2的位置

2.2胃萎縮性炎癥惡變過程中變化最顯著的基因在基因芯片檢測篩選的2 779個差異性表達的基因中，其中在萎縮性炎惡變過程中變化最為顯著的基因，如上調的有CXCL1、S100A9、CXCL8、CHI3L1、S100A8、BCL2AL、SAA1、PI3；下調的有DAZ2、DAZ1、GAST、MSMB、C6orf58、DAZL、KCNE2、GIF、ATP4B、KRT20。具體信息見表1。此外，為了更加直觀的顯示這30個顯著差異表達的基因在萎縮性胃炎組織及胃癌組織中的表達水平，使用Cluster 3.0軟件進行聚類分析，結果用熱圖展示，見圖2。

圖2 熱圖分析展示

2.3胃萎縮性炎癥惡變過程中差異性表達基因的GO富集分析為了探索萎縮性胃炎與胃癌組織中差異性基因表達所代表的生物學功能，對這些基因進行了GO富集分析，GO富集分析是生物信息學研究中非常重要的工具。共篩選出130個富集的生物過程(校正后的P<0.05)及每個生物過程中所包含的差異性表達的基因。其中前10個富集的生物學過程分別是炎癥反應、白細胞趨化作用、細胞遷移、血管生成、對細菌來源分子的反應、細胞運動、細胞黏附作用、血管內皮生長因子的調節、趨化因子介導信號通路、脂多糖介導信號通路。圖3直觀地顯示了差異性表達的基因與富集的生物過程的關聯程度。

表1 在胃癌組織中變化最明顯的15個下調基因和15個上調基因

2.4胃萎縮性炎癥惡變過程中KEGG信號通路分析為進一步研究從胃萎縮性炎惡變至胃癌過程中所涉及的信號通路，對異常表達的基因進行了KEGG信號通路分析。結果顯示，在KEGG PATHWAY數據庫中，以P<0.05為檢驗標準，共篩選出31條信號通路，其中包括TNF信號通路、NF-kappa B信號通路、化學致癌作用、趨化因子信號通路、NOD樣受體信號通路等。圖4總結了前15個差異性最為顯著的信號通路。

2.5差異性表達基因PPI網絡分析為了解差異性表達基因編碼蛋白質的功能及蛋白與蛋白之間的功能，將前100名差異性表達最為顯著的基因輸入STRING 10.0數據庫中，繪制PPI網絡圖(圖5)。研究顯示，在胃萎縮性炎癥惡變至胃癌過程中，差異性表達基因編碼的蛋白質CXCL1、PPBP、CCL20、CXCR2、IL8、STT和SAA1關聯程度強； IL6、IL11、MMP3、CSF3和OSM之間也具有明顯的相互作用。

圖3 GO分析顯示差異性表達的基因富集最顯著的前10個生物過程

圖4 在KEGG PATHWAY數據庫中差異性表達的基因富集最明顯的15條信號通路

圖5 PPI網絡圖

3 討論

慢性炎癥在腫瘤的發生過程中發揮重要作用，研究[4]證明高達25%的惡性腫瘤繼發于慢性炎癥，例如胃癌。胃癌在我國仍具有相當高的發病率，發病機制不清楚，一般認為在萎縮性胃炎基礎上出現腸上皮化生，異型增生，進而發展為胃癌。從萎縮性胃炎惡變至胃癌過程中，分子機制復雜多元，其在遺傳和表觀遺傳改變的積累驅動炎癥細胞進行性轉化為惡性衍生物成為研究熱點。此外，胃癌早期診斷對臨床預后起著很重要的作用，通過對胃癌分子機制的研究，探討胃癌早期診斷顯得非常重要。

為了更加全面的了解胃癌的發病機制，本研究收集了萎縮性胃炎和胃癌組織進行基因芯片檢測，共篩選出2 779個差異性表達的基因，總結了變化最明顯的15個上調基因及15個下調基因。以往的研究已經證明了一些基因在胃癌的發生發展過程中發揮重要作用，例如，基因芯片結果顯示在胃癌組織中高表達的CXCL8可以增加慢性炎癥惡變至腫瘤的風險，并且可以促進胃癌的增殖和轉移[5]。S100A9和S100A8是一類鈣結合蛋白，兩者在多種腫瘤中高表達，可以激活MMP-2的表達和NF-kappa B 促進胃癌細胞侵襲和遷移的，并且可以作為胃癌臨床診斷標志物[6-8]。在胃癌組織中低表達的KCNE2、SOSTDC1、ATP4A和ATP4B均被報道與胃癌的病理機制及臨床特征相關[9-11]。這些基因在胃癌中的表達情況與我們基因芯片檢測的結果一致，說明它們在胃萎縮性炎癥惡變過程中發揮重要作用。

此外，本研究發現了一些在胃癌中未見報道的腫瘤相關基因?；蛐酒Y果顯示CPA2在胃癌組織中低表達，最新的研究證明CPA2缺失與胰腺癌的發生有關[12]；HCAR3的高表達與乳腺癌有關[13]，本研究顯示其在胃癌發生過程中上調。BCL2A1是BCL-2蛋白家族成員，調控細胞凋亡，有研究[14]表明它可以作為MYC的靶分子誘導發生白血病B細胞白血病。這些腫瘤相關基因在胃萎縮性炎癥惡變過程中差異性表達非常顯著，為胃癌發病分子機制的研究指出新的方向。

為了探索差異性表達基因所表示的生理意義，本研究進行了生物信息學分析。GO分析和KEGG信號通路分析分別展示了在胃萎縮性炎癥惡變過程中富集的生物過程和信號通路。如CXCL1、CXCL8、CCL20、IL11共同參與炎癥反應和趨化因子信號通路， BCL2A1 參與NF-kappa B 信號通路，ATP4A和ATP4B共同參與胃酸分泌。ITGAX參與細胞遷移、黏附和運動。腫瘤發生涉及復雜基因網絡的改變，本研究使用了PPI網絡分析胃萎縮性炎惡變過程中基因網絡的改變，更加清晰地顯示基因編碼蛋白之間的聯系程度。高表達 IL8、CCL2、TNF-α和OSM的胃癌干細胞GC-MSCs的培養液可以活化嗜中性粒細胞，進而激活IL6-STAT3信號途徑促進胃癌的遷移[15]，此點在PPI基因網絡圖譜中得到同樣的體現。

本文提供了在胃萎縮性炎癥惡變過程中宏觀基因表達譜的變化，將為今后的研究提供重要的參考依據。并且這些差異性表達的基因可能與胃癌的發病機制和臨床特征相關，但是仍然需要更多的樣本和實驗進一步驗證。