胃癌患者手術前后miRNA-101、miRNA-21表達水平及其臨床意義

張觀朝，徐兵，陳智年

新鄉市中心醫院普通外科，河南新鄉453000 0

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤中，發病率居第5位，病死率居第3位，且呈逐年增高趨勢，嚴重威脅人類生命健康[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年發現的非編碼內源性小分子RNA，負向調控基因表達轉錄，研究顯示，miRNA與多種惡性腫瘤的發生發展有著密切聯系，miRNA-101在多種惡性腫瘤中表達下調，是一種抑癌miRNA[2]。研究認為，miRNA-101可通過作用于髓系細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）基因而發揮抗腫瘤作用[3]。miRNA-21在多種惡性腫瘤中表達存在明顯異常，多項研究顯示miRNA-21在胃癌組織中表達上調，且與患者的臨床分期、淋巴結轉移等有關[4-5]。本研究擬采用實時熒光定量方法動態檢測miRNA-101、miRNA-21在胃癌患者中的表達水平，旨在探討胃癌可能的發病機制及潛在的治療靶點，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年6月至2017年12月新鄉市中心醫院診治的胃癌患者的病歷資料。所有患者均行胃癌根治術，且術前均未接受放化療治療。共納入50例胃癌患者作為胃癌組，其中男29例，女21例；年齡41～80歲，平均（60.28±9.42）歲；分化程度：高分化11例，中分化24例，低分化15例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期22例，Ⅲ期14例，Ⅳ期6例；有淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移19例。另選取同期健康體檢者50例為健康對照組，其中男25例，女25例；年齡35～80歲，平均（58.46±10.29）歲。兩組研究對象的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 血漿標本采集胃癌患者分別于術前、術后1周及術后1個月采集清晨空腹狀態下外周靜脈血5 ml，健康體檢者于體檢時采集外周靜脈血5 ml，3000 r/min離心10 min后分裝血漿與血細胞，-80℃下保存備檢。

1.2.2 血漿總RNA提取每份血標本取400 μl血漿，提取RNA前再次進行離心（12 000 r/min，4℃10 min），取血漿檢測，加入0.8倍血漿體積的TRIzol試劑，充分搖勻，置于冰上15 min，12 000 r/min離心，取上清液。采用核酸蛋白儀對RNA濃度及純度進行測定。

1.2.3 血漿miRNA-101、miRNA-21檢測采用實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法檢測 miRNA-101和miRNA-21，按TaqManmiRNA逆轉錄試劑盒（購自美國Applied Biosystems公司）說明書進行反轉錄。反轉錄條件下轉錄目的miRNA，95℃ 30 s，95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃20 s，共40個循環，以U6為內參基因，每個標本均檢測3次，取所獲取的全部樣本數據的平均值進行分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，重復測量數據采用重復測量的方差分析，兩組比較采用t檢驗；計數資料以例數表示，以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術前胃癌組與健康對照組血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達量的比較

術前胃癌組患者血漿miRNA-101相對表達量明顯低于健康對照組，miRNA-21相對表達量明顯高于健康對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 術前胃癌組與健康對照組血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達水平的比較（± s）

表1 術前胃癌組與健康對照組血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達水平的比較（± s）

組別健康對照組（n=50）胃癌組（n=50）t值P值miRNA-101 7.95±2.04 1.82±0.56 20.490 0.000 miRNA-21 0.97±0.04 8.26±1.83 28.162 0.000

2.2 胃癌患者手術前后血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達量的比較

與術前比較，術后1周及術后1個月胃癌患者血漿miRNA-101相對表達量逐漸增高，血漿miRNA-21相對表達量逐漸降低，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表 2）

表2 50例胃癌患者手術前后血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達水平的比較（± s）

表2 50例胃癌患者手術前后血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達水平的比較（± s）

注：a與術前比較，P<0.05；b與術后1周比較，P<0.05

miRNA-101 1.82±0.56 5.78±1.27a 7.23±1.86a b 218.396<0.01 miRNA-21 8.26±1.83 3.23±0.85a 1.42±0.37a b 447.702<0.01時間術前（n=50）術后1周（n=50）術后1個月（n=50）F值P值

2.3 不同臨床特征的胃癌患者術前血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達量的比較

不同分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況的胃癌患者術前血漿miRNA-101相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=66.285，t=6.104、9.579；P﹤0.05）；不同分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況的胃癌患者術前血漿miRNA-21相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=53.287，t=14.204、6.534；P﹤0.05）；而不同性別、年齡胃癌患者術前血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達量比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征胃癌患者術前血漿miRNA-101、miRNA-21的相對表達水平（ n=50）

3 討論

miRNA是一類真核生物內源性非編碼單鏈的小RNA分子，長19～23個核苷酸，進化上呈高度保守，能夠調節信使RNA的翻譯，并在轉錄后水平負調控基因的表現[6]。近年來，miRNA已成為腫瘤診斷及治療的研究熱點。miRNA-101被發現在多種惡性腫瘤組織中呈低表達，其低表達與腫瘤的發生、發展呈正相關，且低表達miRNA-101的腫瘤患者生存率較低[7]。miRNA-21是最早在人類基因組中檢測到的miRNA之一，其在多種惡性腫瘤組織中呈過表達，是實體瘤中最常見的呈高表達的miRNA之一，可能作為一種癌基因參與了腫瘤的發生、發展[8-9]。

外周血腫瘤標志物的檢測有創傷小、易于檢測、可重復性高等優點，是腫瘤診斷的理想手段。已有研究證實，miRNA-101在胃癌組織中呈低表達，miRNA-21在胃癌組織中呈高表達，且與患者的臨床分期、淋巴結轉移等有關[10-11]。有研究顯示，血漿miRNA-21診斷大腸癌的靈敏度為84.5%，特異度為74.4%，故血漿miRNA-21可能成為腫瘤診斷的新手段[12]。本研究結果顯示，術前胃癌組患者血漿miRNA-101相對表達量明顯低于健康對照組，miRNA-21相對表達量明顯高于健康對照組，這與miRNA-101在子宮內膜癌中的變化類似[13]，提示miRNA-101、miRNA-21可能參與了胃癌的發生。另有研究表明，大腸癌組織miRNA-21表達量較癌旁組織明顯增多，亦提示miRNA-21參與了腫瘤的發生發展[14]。本研究未對此進行對比分析，有待進一步補充以增強結果說服力。本研究動態檢測胃癌患者血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達量發現，與術前比較，術后1周及術后1個月胃癌患者血漿miRNA-101相對表達量逐漸增高，血漿miRNA-21相對表達量逐漸降低，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。即手術除去腫瘤后，血漿miRNA-101表達水平迅速升高，miRNA-21表達水平迅速降低，說明miRNA-101、miRNA-21與腫瘤發生密切相關，其表達異常可促使腫瘤發生，且通過檢測二者表達變化有助于評估手術療效。不少研究認為，miRNA-101、miRNA-21與腫瘤病理分期、浸潤深度、淋巴結轉移等有關[15-16]。本研究顯示，不同分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況的胃癌患者術前血漿miRNA-101、miRNA-21相對表達量比較，差異均有統計學意義，這與上述研究相符。表明血漿miRNA-101、miRNA-21的檢測對胃癌分期及轉移判斷有重要意義。

綜上所述，胃癌患者血漿miRNA-101呈低表達，miRNA-21呈高表達。通過檢測血漿miRNA-101、miRNA-21的表達變化對判斷腫瘤分化程度、臨床分期、手術療效有著一定價值，有望成為腫瘤診斷及隨訪的新型手段。