一株產紅色素內生真菌色素的穩定性研究

廖月姣 蒙南村 蔣青玲

摘 要：以艾草根塊分離得到的內生真菌WS-221為研究對象，以色素提取液吸光度為重要指標，對該菌所產的色素進行了穩定性研究。結果表明：該菌所產色素提取液在490nm處出現最大吸收峰。紫外光對色素穩定性影響較小，色素溶液中添加適量Na+、K+、Al3+具有一定的增色作用，并且食鹽濃度在0.2g/mL時增色效果明顯。綜合評價，該菌所產色素穩定性良好，具有廣泛的工業價值。

關鍵詞：內生真菌;色素提取;色素穩定性

中圖分類號 TS201.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）05-0023-03

Abstract：The endophytic fungus WS-221 isolated from the wormwood root block was used as the research object，and the stability of the pigment produced by the fungus was studied by using the absorbance of the pigment extract as an important index.The results showed that the pigment extract produced by this strain showed the maximum absorption peak at490 nm.Ultraviolet light has little effect on pigment stability.Adding proper amount of Na+，K+ and Al3+ to the pigment solution has certain color enhancement effect on the pigment and the pigment coloration effect is obvious when the salt concentration is 0.2g/mL.Considering comprehensively，the pigment produced by this strain has good stability and has wide industrial value.

Key words：Endophytic fungi;Pigment extraction;Pigment stability

內生真菌是生活或在其生活史的某一個階段生活在健康植物體內[1-2]，與植物協同進化，在進化過程中逐漸演變為共生關系的一種真菌，具有多樣性，廣泛分布于植物體內[3]。由于植物種類、環境條件、生長階段等因素的不同，導致植物組織中內生真菌的數量和種類存在較大差異[4]。植物部位的不同，內生菌的種類及多樣性也存在顯著差異[5]，內生真菌在植物體內對宿主暫時沒有致病性[6]，同時內生真菌之間也有著從拮抗到互利的多種共生關系[7]。

艾草又名香艾、艾蕭、艾蒿等，具有驅蚊、抗菌、護肝之功效，其葉和莖部均可產生奇特香味，對具有藥用價值的植物中內生真菌的研究更具研究價值。由于天然色素安全無毒，且具有一定的營養價值，深受人們喜愛[8]。內生真菌所產色素為天然色素，并且真菌色素與植物色素相比，其不受環境、氣候、空間的影響[9]，可以通過大規模的工業生產和發酵生產，既降低了成本，又提高了產量，增加經濟效益[10-11]。本研究以艾草根塊內生真菌WS-221為研究對象，對其水溶性紅色素的穩定性進行了研究，為進一步研究利用該菌所產色素提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真菌菌株來源 菌株，從野生艾草根塊分離純化得到。

1.1.2 培養基 平板使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL;發酵培養基（PDB）：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL。

1.1.3 儀器設備與試劑 MaxQ436大型落地式恒溫搖床，美國Thermofisher公司;UV-1800紫外可見光分光光度計，日本島津公司;HWS型智能恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司;TG16-WS臺式高速離心機，湘儀離心機;無水乙醇、葡萄糖、食鹽、氯化鎂、氯化鈣等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株發酵培養 用直徑為1cm的打孔器獲取生長在PDA培養基上具有8d菌齡的菌落，將菌餅置于裝有150mLPDB發酵液的250mL錐形瓶中，在培養條件為28℃、轉速為150r/min的條件下發酵培養15d。

1.2.2 菌株形態學觀察 用鑷子挑取培養基上的菌落放置于滴有蒸餾水的載玻片上進行壓片，再通過生物顯微鏡進行觀察。

1.2.3 色素提取 將發酵培養15d的菌液過濾，獲得菌絲，稱取菌絲1g分別溶于10mL蒸餾水和95%乙醇2種溶液中超聲破碎35min，在5000r/min的轉速條件下離心5min，獲得紅色素上清液。

1.2.4 吸收光譜曲線的測定 將獲得的紅色素上清液用紫外分光光度計于460～520nm范圍內進行檢測。使用origin軟件進行分析，以確定最佳波長并測得最佳波長條件下色素在2種不同提取溶劑中的最大吸光度。

1.2.5 紫外光對紅色素穩定性的影響 取紅色素上清液放置在波長為210nm的紫外燈下分別照射10、20、30、40、50、60、70min，將照射的紅色素上清液在490nm處測定其吸光度。

1.2.6 pH對紅色素穩定性的影響 取紅色素上清液，用HCl和NaOH調節pH值為2、4、6、8、10，在黑暗的條件下放置2h，在490nm處測定色素提取液的吸光度。

1.2.7 金屬離子對紅色素穩定性的影響 取紅色素上清液配制成含不同金屬離子Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+濃度均為0.5g/mL的紅色素溶液，在黑暗的條件下放置0、2、4、6、8h，在490nm處測定紅色素溶液的吸光度。

1.2.8 不同濃度食鹽對紅色素穩定性的影響 取紅色素上清液將其配制成0.1g/mL、0.2g/mL、0.3g/mL、0.4g/mL、0.5g/mL的氯化鈉溶液，在黑暗的條件下放置2h，在490nm處測定紅色素溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 形態學特征 該菌菌落為淡紅色，菌落表面濕潤有凸起絮狀，菌絲紅色質密。其孢子存在于瓶梗上，并在頂端形成球團（圖1）。

2.2 2種不同溶劑對色素提取的影響 將2種不同溶劑提取的紅色素在UV1800紫外分光光度計下進行檢查，結果如圖2所示，波長在490nm處時出現最大吸收峰。本研究選取成本較低的蒸餾水作為溶劑提取色素，選取490nm作為該紅色素的特征吸收波長，從而獲得紅色素提取溶液，并在D490處測得提取液的吸光度為0.388。

2.3 紫外光對紅色素穩定性的影響 由圖3所示，將紅色素提取液放置于210nm紫外光下進行照射，通過控制紫外照射時間，結果顯示，在不同時間照射下該色素吸光度只在較小的范圍內進行波動，并且在40～70min范圍內色素吸光度高于原液吸光度，說明紫外對該色素穩定性影響較小，而且在一定條件下還具有增色作用。故該色素具有較好的抗紫外能力。

2.4 pH對紅色素穩定性的影響 由圖4可知，該色素對pH較為敏感，當pH為6時提取液吸光度與原液持平，當pH在2～4范圍內時出現較小值，且在pH為2時色素穩定性最差，說明在酸性條件對色素的穩定性影響較大。堿性條件對色素穩定性有一定影響，但對堿性條件的對抗性比酸性條件強，說明該色素的耐酸性較差。故在實際應用的過程中，應盡量避免酸性物質的使用。

2.5 金屬離子對色素穩定性的影響 由表1可知，在紅色素溶液中添加各種金屬離子之后，在不同的時間段部分金屬離子對色素的吸光度存在一定的影響。溶液中添加Na+、Ca2+、Al3+、Mg2+之后，在2h時達到最大值，并在4～8h范圍內色素存在較小的波動。在紅色素溶液中添加K+之后，在0h時有最大值，在2～8h范圍內色素的吸光度減小，增色效果存在一定的變化。說明Na+、K+、Al3+在短時間內對該色素具有增色作用。

2.6 不同濃度的食鹽對色素穩定性的影響 由圖5所示，該色素在NaCl濃度為0.2g/mL時出現最大值，當Na+濃度在0.3～0.5g/mL時，其吸光度緩慢增加，且整體吸光度大于原液吸光度，說明Na+濃度對該色素有一定影響，但其影響有限，并且在紅色素提取液中加入食鹽對色素有一定的增色作用。故在工業生產過程中適量加入食鹽可以起到增色效果。

3 結論

從野生艾草中分離出來的產紅色素內生真菌WS-221在PDA固體培養基培養的前期菌絲為白色，培養5d左右菌絲變為淡紅色，背面為紅色，在搖瓶培養15d左右色素產量達到最大，在之后的培養過程中色素產量幾乎不變。實驗表明，紫外對該真菌產生的紅色素的穩定性影響較小，并且紅色素的吸光度只在較小的范圍內進行波動;在pH為6～10時存在一定的穩定性，且在pH為6時色素吸光度幾乎與原液相同;在色素溶液中添加Na+、K+、Al3+之后，在短時間內具有一定的增色作用;不同濃度的食鹽對該色素有一定的影響，且在0.2g/mL出現最大值，具有較好的增色作用，故在生產利用該色素時可以添加一定量的Na+，以提高其色澤。如今具有保健功能的天然紅色素應用于食品、化妝品、醫藥等領域引起了人們的廣泛關注[12]，對天然色素穩定性的研究具有廣泛的工業價值。

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（責編：張宏民）