MiR-483在人稽留流產胎盤絨毛組織中表達模式

董藝超，寧安鳳，朱旗，馬旭*，夏紅飛*

(1.國家衛生計生委科學技術研究所遺傳優生中心，北京 100081；2. 北京協和醫學院研究生院，北京 100730；3. 佳木斯大學生命科學院，佳木斯 154007)

MicroRNA (miRNA) 是一類長度為18～24 nt的單鏈非編碼RNA分子，廣泛存在于各種動植物體內，其在轉錄后基因表達調控中發揮重要作用[1-2]。許多研究顯示miRNAs在受精卵發育、胚胎植入和復發性自然流產等生殖疾病中發揮重要作用[3-5]。稽留流產(MA) 又稱為過期流產或死胎不下，通常指妊娠20周之前胚胎或胎兒已經死亡并且滯留在宮腔內未能及時自然排出者[6]。近年來，稽留流產呈現出明顯上升的趨勢，造成稽留流產的原因較多，但機制尚不明確。MiR-483是一個在腫瘤發生中起重要作用的miRNA[7-8]，胚胎植入過程中滋養層細胞的侵潤與腫瘤的遷移非常相似[9]，胚胎植入失敗是引起自然流產的重要原因，稽留流產是一種特殊性的自然流產，但現階段miR-483是否與稽留流產相關尚不清楚。本研究通過對收集的稽留流產胎盤組織進行miR-483表達模式的分析，以期為深入探究miR-483在稽留流產中的作用提供有價值的參考資料。

資料與方法

一、研究對象

80例稽留流產患者絨毛組織是從石家莊第六醫院收集，并且及1：1匹配正常人工流產孕婦的絨毛組織。年齡20～40歲，孕周8～12 w。排除染色體異常、感染性疾病、生殖器官異常、免疫功能障礙以及內分泌失調等情況。依據《婦產科學》制定了稽留流產的診斷標準[10]。運用統計學的方法分析兩組患者的一般資料后，未出現顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

二、方法

1. 主要試劑：聚偏二氟乙烯(PVDF)，Bestar?SybrGreen qPCR Mastermix(DBI，德國)，地高辛雜交液以及抗體(Roche，德國)，TRIzol reagent(Invitrogen，美國)，miRNA cDNA Synthesis Kit(ABM，加拿大)，miR-483 qRT-PCR Primer Set(RIBBIO，廣州)，miR-483 地高辛探針(上海生工，上海)。

2. 總RNA的提取：取50～100 mg絨毛組織樣品，用已滅菌的剪刀將組織剪碎，加入1 ml Trizol，用勻漿器破碎至勻漿，收集上清轉入Eppdoff管，室溫靜置5 min加入0.2 ml三氯甲烷，渦旋15 s，室溫靜置30 min后，于4℃離心機中 12 000 rpm離心15 min，取上清液至新的Eppdoff管中，加入2倍上清體積的異丙醇，-20℃沉淀過夜，4℃ 12 000 rpm離心10 min后棄去上清液，加入1 ml DEPC水配置的 75%乙醇，4℃ 12 000 rpm離心5 min，倒盡液體，除去管底殘液，自然干燥3 min，加入適量DEPC水溶解進行濃度測定。

3. 定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)：取500 ng Total RNA、miRNA cDNA Synthesis Kit、miR-483 反轉錄引物、DEPC水按照說明書進行反轉錄，反應體系為10 μl。反應條件：42℃ 30 min，70℃ 10 min。用反轉錄得到的產物cDNA作為模板，依據Bestar?SybrGreen qPCR Master mix的使用說明書，選用10 μl的反應體系，并以U6作為內參，擴增條件為：95℃ 2 min，95℃ 10 s和 60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環。用2-ΔΔCt法計算miRNA相對表達量。每個樣品檢測三個復孔，實驗進行三次重復。

4. 原位雜交：石蠟切片經烤片脫蠟至水化后，經0.2 mol/L的鹽酸處理后，滴加適量蛋白酶K，再用4%多聚甲醛進行固定，然后置于預雜交液中，42℃預雜交1 h。將地高辛標記的miR-483探針加熱至80℃并持續10 min，將變性好的探針與與雜交液，按照1∶250的比例進行稀釋后滴加到玻片上，40℃雜交過夜。2×SSC緩沖液洗片后，在濕盒中用封閉劑室溫孵育30 min后，加入稀釋好的抗地高辛抗體4℃孵育過夜。恢復至室溫后用NBT/BCIP顯色。顯色結束后用PBS清洗撥片，梯度脫水后用中性樹脂封片。采用地高辛標記的LNA-scrambled探針進行雜交來作為陰性對照

三、統計學分析

結 果

1.稽留流產胎盤絨毛組織中miR-483的總體表達模式

80例稽留流產和正常對照胎盤絨毛組織不分組整體分析顯示，miR-483在稽留流產患者胎盤組織中有上調的趨勢，但沒有顯著性差異 (圖1)。

圖1 qRT-PCR方法檢測miR-483在稽留流產胎盤組織中總體表達模式

2. miR-483隨年齡增長在稽留流產胎盤絨毛組織中的表達變化

年齡與稽留流產的發生密切相關，因而依據患者的年齡將其分為四組，依次為：周齡小于等于25歲(Y≤25)、26～30歲(Y 26～30)、31～35歲(Y 31～35)、大于等于36歲(Y ≥ 36)。將qRT-PCR的檢測結果按照年齡段整體分析顯示：與對照組相比，稽留流產患者胎盤絨毛組織中miR-483的表達在Y≤25組明顯降低(P<0.01)；在Y 26～30組顯著降低(P<0.01)；在Y 31～35組明顯上調(P<0.05)；在Y≥ 36組沒有明顯變化(圖2)。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 qRT-PCR方法檢測miR-483在不同年齡段稽留流產胎盤組織中總體表達模式

3.不同年齡組稽留流產胎盤絨毛組織中miR-483表達量的個體化差異

對不同年齡段配對的MA組和對照組進行miR-483表達趨勢分析，統計具有顯著性差異的表達趨勢的陽性率。分析發現，在Y≤25組，miR-483的表達在100%MA患者的胎盤絨毛組織中明顯下調(P均<0.01)；在Y 26～30組，80%MA患者絨毛組織中miR-483表達明顯下調(P<0.05和P<0.01)；在Y 31～35組，30%MA患者絨毛組織中miR-483表達下調(P<0.05 或P<0.01)，10%MA患者絨毛組織中miR-483表達明顯上調(P<0.05)，其余MA患者miR-483的表達沒有明顯差異；在Y ≥ 36組，20%MA患者絨毛組織中miR-483表達均明顯下調(P<0.01)，20%MA患者絨毛組織中miR-483表達上調(P<0.05或P<0.01)，其余MA患者miR-483的表達沒有明顯差異(圖3)。

4.在稽留流產胎盤絨毛組織中miR-483的表達位點

由于Real-time 結果顯示在30歲以下MA患者胎盤絨毛組織中miR-483的表達量主要表現為下調，而在30歲以上的MA患者中并未呈現出顯著的趨勢，因此，在接下來的檢測中，將MA患者以30歲為界分成兩個組別(圖4)。原位雜交分析miR-483的表達定位結果顯示，無論在MA組還是對照組，miR-483的陽性信號主要定位于胎盤絨毛合體滋養層和間質細胞。在Y≤ 30時，對照組miR-483的陽性信號強于MA組，在Y≥30時，對照組的miR-483陽性著色強度與MA組接近。

A：Y ≤25組的miR-483差異表達結果；B：Y 26～30組的miR-483差異表達結果；C：Y 31～35組的miR-483差異表達結果；D：Y ≥36組的miR-483差異表達結果；與匹配的對照組比較,**P<0.01，*P<0.05圖3 qRT-PCR方法檢測miR-483在不同年齡段稽留流產胎盤組織中表達的個體化差異

上圖×100，下圖×200，紅色箭頭表示miR-483陽性信號圖4 原位雜交法檢測在稽留流產胎盤組織中miR-483的表達位點

討 論

稽留流產作為婦產科的一種常見疾病發病因素很多，但確切的致病機制現階段尚不明確，流行病學調查研究的結果表明[10-11]，大約有2%的處于妊娠10-14周的單胎孕婦會發生稽留流產，且我國稽留流產的發生率已經超7%，而且近年來呈現出逐漸上升趨勢。現階段已有研究表明miR-483與胃癌、肝癌、腎上腺皮質癌等密切相關[7，12-13]。眾所周知，胚胎植入過程中滋養層細胞的浸潤與腫瘤的遷移非常相似[9]，胚胎植入失敗會引起自然流產的發生，而miR-483是否與自然流產的一個特殊類型稽留流產相關尚不清楚。本研究首次報道了miR-483在稽留流產絨毛組織中的表達模式，并為了進一步揭示miR-483與稽留流產的關系奠定了基礎。

本研究利用采集的稽留流產胎盤絨毛組織，對miR-483的表達模式進行分析，發現當孕婦年齡在30歲以下時，miR-483表達明顯降低，而當孕婦年齡在30歲以上時，miR-483在對照組與病理組中的表達水平并未發現有明顯的差異，由此可知，miR-483的表達水平在孕婦30歲前后表現出的差異可能與年齡的改變密切相關。而很多學者的研究顯示孕婦的年齡與各種妊娠疾病的發生高度相關[14-15]，miR-483的差異表達是否影響稽留流產的發生將是我們進一步研究的方向。

MiR-483表達下調可以抑制癌癥細胞的生長和浸潤[16]，但其在胎盤組織細胞中的作用機制尚不清楚。我們利用原位雜交技術定位了miR-483的結果顯示，miR-483主要表達于合體滋養層細胞和間質細胞中，有研究表明這兩類細胞在胎兒生長發育過程中，特別是在胎盤血管形成，以及子宮胎盤間的循環體系建立過程起到了重要作用[17-18]。本研究發現當孕婦年齡≤30時，miR-483在稽留流產胎盤組織中表達水平呈現下調，而這一趨勢可能抑制了合體滋養層細胞和間質細胞的增殖與浸潤能力，引起胎盤發育異常，母嬰間物質交換障礙，不利于營養的輸送，進而引起胎兒發育停止，誘導了稽留流產的發生。

綜上所述，miR-483在小于30歲稽留流產患者胎盤組織表達降低，其主要定位于合體滋養層和間質細胞中。miR-483表達下調具體的功能以及其靶基因的相關蛋白的生物學功能還有待于進一步闡明。但相信，隨著對miR-483的分子機制和生物學功能與疾病之間的關系的進一步研究，胎盤組織中 miR-483的表達水平對稽留流產早期診斷方面可能展現出廣闊的臨床應用前景。通過對人稽留流產胎盤絨毛組織中miR-483表達模式的分析，以期為今后深入研究miRNAs在稽留流產中的作用提供參考。

致 謝

衷心感謝石家莊市第六醫院對于組織標本采集工作提供的支持與幫助，為本研究提供了珍貴的臨床樣本。