地貧孕婦與非地貧孕婦羊水染色體的對(duì)比分析

韋世錄 余奇松 陳萍

廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院（南寧530021）

羊水染色體檢查是遺傳病產(chǎn)前診斷的重要手段，通過羊水細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行染色體核型分析，可了解胎兒染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)是否正常，診斷胎兒染色體病，可大大減少先天性缺陷患兒的出生。地中海貧血是單基因遺傳病，在我國(guó)主要發(fā)生在長(zhǎng)江以南地區(qū)，以廣東、廣西多見，廣西部分地區(qū)人群中α-地中海貧血6.64%～15.35%，β-地中海貧血3.61%～6.45%［1-2］。中間型及重型地中海貧血患兒的輸血及去鐵治療需要高昂費(fèi)用［3-5］，給社會(huì)和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。針對(duì)地中海貧血孕婦，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中，更多關(guān)注的是胎兒是否為中間型或重型地中海貧血，而其染色體結(jié)果關(guān)注較少。現(xiàn)將地中海貧血其胎兒羊水染色體異常核型的檢出率與非地中海貧血孕婦是否存在差異，經(jīng)比較、分析，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2016年1月至2018年8月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷與遺傳病診斷科行羊膜腔穿刺術(shù)進(jìn)行羊水染色體檢查的孕婦2 144例，按孕婦是否患有地中海貧血進(jìn)行分組，地貧組635例，年齡16～48歲，孕周16～24周；非地貧組1 509例，年齡16～47歲，孕周16～24周。納入標(biāo)準(zhǔn)：有羊膜腔穿刺指征或患者自愿要求進(jìn)行羊膜腔穿刺并均已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：有羊膜腔穿刺術(shù)禁忌癥。地中海貧血孕婦指的是經(jīng)地中海貧血基因檢測(cè)診斷為α-地中海貧血、β-地中海貧血或α復(fù)合β地中海貧血的孕婦。

1.2 方法

1.2.1 羊膜腔穿刺指征主要包括高齡孕婦，胎兒超聲異常，孕中期血清學(xué)篩查異常，無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(cè)結(jié)果為高危者，孕早期致畸物質(zhì)接觸史，不良孕產(chǎn)史，夫婦一方為染色體異常。

1.2.2 羊水標(biāo)本的采集及培養(yǎng)孕婦排空膀胱，取仰臥位，于實(shí)時(shí)四維彩色多普勒超聲波診斷儀（美國(guó)GE公司）引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取孕婦羊水20 mL，送層流培養(yǎng)室的超凈工作臺(tái)內(nèi)分裝至2只無菌離心管，2 000 rpm離心5 min，棄上清液，每管加入5 mL羊水培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司），無菌吸管吹打混勻，接種于2個(gè)50 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。第7～8 d倒置顯微鏡下觀察羊水細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，換液。

1.2.3 羊水細(xì)胞染色體制備換液次日加入適量秋水仙素，2.5 h后收獲細(xì)胞，然后經(jīng)低滲、預(yù)固定、固定、滴片、烤片等處理，再常規(guī)G顯帶處理。

1.2.4 染色體核型分析應(yīng)用全自動(dòng)染色體圖像掃描分析系統(tǒng)（德國(guó)Zeiss公司）對(duì)羊水載玻片標(biāo)本進(jìn)行全自動(dòng)掃描、拍照，獲取羊水細(xì)胞中期分裂相染色體圖片。應(yīng)用染色體分析軟件對(duì)分裂相染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)與核型排列，計(jì)數(shù)20個(gè)，核型分析7個(gè)，若發(fā)現(xiàn)嵌合體，則增加計(jì)數(shù)和分析。異常核型包括數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常及嵌合體，不包括染色體正常多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)兩組羊水染色體異常核型檢出率、異常核型分布以及不同羊膜腔穿刺指征異常核型檢出率進(jìn)行醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)定為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率2 144例孕婦羊水標(biāo)本中，羊水細(xì)胞培養(yǎng)首次培養(yǎng)成功率為99.11%（2 125/2 144），首次培養(yǎng)失敗率為0.89%（19/2 144）。首次培養(yǎng)失敗的19例孕婦中，13例孕婦接受第2次羊膜腔穿刺術(shù)，二次培養(yǎng)成功率為100%（13/13），6例孕婦改臍靜脈穿刺并順利完成胎兒染色體檢查。羊水細(xì)胞培養(yǎng)總成功率為99.72%（2 138/2 144）。

2.2 地貧組的地貧基因類型及其染色體異常核型檢出率2 144例孕婦中，非地貧組占70.38%（1 509/2 144），地貧組占29.62%（635/2 144），其中α-地中海貧血占58.42%（371/635）、β-地中海貧血34.02%（216/635）及α復(fù)合β地中海貧血7.56%（48/635）。α-地中海貧血孕婦檢出異常核型19例，檢出率為5.12%（19/371）；β-地中海貧血孕婦檢出異常核型8例，檢出率為3.70%（8/216）；α復(fù)合β地貧未見異常核型。

2.3 兩組羊水染色體異常核型檢出率比較2 144例羊水標(biāo)本共檢出異常核型134例，檢出率為6.25%，其中地貧組檢出率為4.25%（27/635），非地貧組檢出率為7.09%（107/1 509），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可以認(rèn)為兩組羊水染色體異常核型檢出率有差別。

2.4 兩組羊水染色體異常核型分布情況兩組按數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常、嵌合體統(tǒng)計(jì)染色體異常核型分布情況見表1。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），尚不能認(rèn)為兩組羊水染色體異常核型分布有差別。

表1 兩組羊水染色體異常核型分布Tab.1 Abnormal chromosome karyotype distribution in two groups of amniotic fluid 例

2.4.1 數(shù)目異常地貧組“數(shù)目異常”11例，其中性染色體數(shù)目異常4例：染色體數(shù)47，XXX綜合征2例；染色體數(shù)47，XXY綜合征1例；染色體數(shù)45，X單體1例。常染色體三體7例：21-三體5例，18-三體2例。

非地貧組“數(shù)目異常”48例，其中性染色體數(shù)目異常10例：染色體數(shù)47，XXX綜合征3例；染色體數(shù)47，XXY綜合征6例；染色體數(shù)45，X單體1例。常染色體三體34例：21-三體22例、18-三體10例、13-三體2例。三倍體1例：染色體數(shù)69，XXX。標(biāo)記染色體3例：染色體數(shù)47，XY/XX，+mar。

2.4.2 結(jié)構(gòu)異常地貧組“結(jié)構(gòu)異常”11例，其中性染色體結(jié)構(gòu)異常2例：均為inv（Y）臂間倒位；常染色體結(jié)構(gòu)異常9例：t（11；18）相互易位、rob（13；14）羅氏易位、inv（5）短臂臂內(nèi)倒位各 1例，t（1；12）相互易位2例，inv（9）臂間倒位4例。

非地貧組“結(jié)構(gòu)異常”47例，其中性染色體結(jié)構(gòu)異常3例：t（X；19）相互易位、i（X）長(zhǎng)臂等臂染色體、inv（Y）臂間倒位各1例；常染色體結(jié)構(gòu)異常44例：t（1；4）、t（1；5）、t（1；10）、t（3；9）、t（3；10）、t（8；11）、t（8；15）相互易位、rob（13；15）、rob（13；22）羅氏易位、inv（4）臂間倒位、inv（5）臂內(nèi)倒位，ins（4；2）正向插入，del（4）（p15.2）、add（7）（p22）各 1例，rob（14；21）羅氏易位 2例，add（15）（p13）2例，inv（9）臂間倒位26例。

2.4.3 嵌合體地貧組“嵌合體”5例，其中性染色體嵌合3例：46，XX/46，XY嵌合體1例，45，X/46，XY嵌合體2例；常染色體嵌合2例：21-三體嵌合、13-三體嵌合各1例。

非地貧組“嵌合體”12例，其中性染色體嵌合9 例：47，XXY/46，XY 嵌合體、46，X，i（X）（q10）/45，X嵌合體各1例，46，XX/46，XY嵌合體3例，45，X/46，XY 嵌合體2例，45，X/46，XX 嵌合體2例；常染色體嵌合3例：21-三體嵌合、20-三體嵌合、2-三體嵌合各1例。

2.5 兩組不同羊膜腔穿刺指征異常核型檢出率比較兩組不同羊膜腔穿刺指征孕婦的染色體異常核型檢出率分布情況見表2。各羊膜腔穿刺指征中，非地貧組異常核型檢出率均高于或等于地貧組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2.379，P＞0.05），尚不能認(rèn)為兩組不同羊膜腔穿刺指征染色體異常核型檢出率有差別。“夫婦染色體異常”指征中，兩組檢出率均為100%，“無創(chuàng)高危”指征中，非地貧組檢出率為100%，地貧組為60.00%，檢出率非常高。

表2 兩組不同羊膜腔穿刺指征異常核型檢出率比較Tab.2 Comparison of abnormal detection rates of different types of amniocentesis in two groups 例

3 討論

地中海貧血是由于某類珠蛋白合成受抑所引起的溶血性貧血，但并不涉及血紅蛋白結(jié)構(gòu)的異常，如α-珠蛋白合成受抑者稱α-地中海貧血，β-珠蛋白合成受抑者稱β-地中海貧血。患有地中海貧血的夫婦，在妊娠期間，臨床醫(yī)師根據(jù)孕婦及丈夫的地中海貧血類型，做出是否進(jìn)行胎兒地中海貧血產(chǎn)前診斷的必要性，以避免中間型或重型地中海貧血患兒的出生，這是以往地中海貧血孕婦研究的主要關(guān)注點(diǎn)，而對(duì)其染色體結(jié)果關(guān)注較少。攜帶地中海貧血基因的孕婦，其胎兒染色體異常核型檢出率是否不同。本研究中地貧組與非地貧組的羊水染色體異常核型檢出率分別為4.25%（27/635），7.09%（107/1 509），地貧組低于非地貧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而兩組羊水染色體異常核型在數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常、嵌合體分布以及不同羊膜腔穿刺指征檢出率的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能的原因：（1）地貧組樣本偏少，引起統(tǒng)計(jì)學(xué)上的誤差；（2）地貧孕婦因妊娠重型或中間型地貧胎兒，孕早期被引產(chǎn)，其染色體可能存在異常。

地貧組羊水染色體異常核型檢出率低于非地貧組，這對(duì)產(chǎn)前診斷臨床工作及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)有一定的指導(dǎo)意義。在日常產(chǎn)前遺傳咨詢中，地中海貧血孕婦可能會(huì)提出“地貧是否導(dǎo)致胎兒染色體異常或者增加胎兒染色體異常的幾率”的問題，少數(shù)重型地貧患兒生育史的地中海貧血孕婦，對(duì)于胎兒是否為重型地貧或染色體異常，往往非常關(guān)注，妊娠期間心理負(fù)擔(dān)較大，臨床醫(yī)師可據(jù)此提供更準(zhǔn)確的咨詢，消除其思想包袱。實(shí)驗(yàn)室的胎兒染色體檢測(cè)要求認(rèn)真、細(xì)致、客觀，不管標(biāo)本來自地中海貧血孕婦還是非地中海貧血孕婦，應(yīng)一視同仁，保證檢測(cè)結(jié)果客觀、準(zhǔn)確，減少主觀因素的誤差。本研究染色體異常核型檢出率為6.25%（134/2 144），與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道一致［6-7］。鄧國(guó)生等［8］對(duì)266例地貧孕婦的羊水染色體核型進(jìn)行分析，異常核型（包括正常多態(tài)性）的檢出率為6.0%，剔除染色體正常多態(tài)性，異常核型檢出率應(yīng)為4.51%，與本研究地貧組異常核型檢出率4.25%相近。

羊膜腔穿刺術(shù)通過抽取羊水進(jìn)行檢驗(yàn)，以了解胎兒發(fā)育情況以及治療胎兒病癥或終止妊娠，是妊娠中期產(chǎn)前診斷的重要手段。不管孕婦是否為地中海貧血基因攜帶者，只要有羊膜腔穿刺適應(yīng)癥而無禁忌癥，可行羊膜腔穿刺術(shù)。孕婦年齡、唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)、超聲異常、不良接觸史（如放射線，農(nóng)藥）、不良孕產(chǎn)史及夫婦染色體異常是導(dǎo)致胎兒染色體異常較為常見的危險(xiǎn)因素，是羊膜腔穿刺的主要指征。隨著社會(huì)的發(fā)展和二胎政策的放開，孕婦高齡化的趨勢(shì)日趨明顯。有研究顯示［9］：二孩政策開放后，有產(chǎn)前診斷需求的高齡孕婦增加，由27.2%上升到37.9%。孕婦年齡越大，胎兒染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)就越大，可能與卵子老化有關(guān)。卵子不同程度的老化，將導(dǎo)致減數(shù)分裂過程中染色體不分離的幾率增加［10-11］。國(guó)內(nèi)報(bào)道夫婦染色體異常易導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)及胎兒染色體異常［12-13］，“夫婦一方為染色體異常攜帶者”孕育染色體異常胎兒具有較大的風(fēng)險(xiǎn)。親代染色體異常涉及染色體條數(shù)不同，子代染色體異常的遺傳概率也不同。親代染色體異常涉及染色體條數(shù)越多，子代染色體異常的可能性越大。羅小金等［14］對(duì)96例胎兒染色體倒位病例進(jìn)行回顧性分析，顯示遺傳自雙親87例，遺傳概率為90.6%。本研究有9例“夫婦一方為染色體異常攜帶者”，其中4例涉及1條異常染色體，5例涉及2條異常染色體，且遺傳概率均為100%。因此，夫婦一方確認(rèn)為染色體異常攜帶者時(shí)，妊娠期間建議進(jìn)行胎兒染色體檢查，以確定胎兒染色體是否正常。本研究9例“夫婦一方為染色體異常攜帶者”，遺傳概率100%，可能的原因有三：一是夫婦異常的染色體本身易遺傳給胎兒；二是胎兒染色體為非平衡易位，孕早期易停育、死胎或流產(chǎn)；三是樣本量少，存在偶然因素。

綜上所述，在產(chǎn)前診斷臨床實(shí)踐中，臨床醫(yī)師根據(jù)高齡孕婦、唐氏高危、超聲異常、不良孕產(chǎn)史、不良接觸史、無創(chuàng)高危、夫婦染色體異常等不同的產(chǎn)前診斷指征，給予孕婦不同的遺傳咨詢。本研究中，產(chǎn)前診斷指征“無創(chuàng)高危”及“夫婦染色體異常”的羊水染色體異常核型檢出率均較高，尤其夫婦染色體異常，臨床上應(yīng)高度重視，避免遺漏。針對(duì)地中海貧血孕婦的產(chǎn)前遺傳咨詢，咨詢醫(yī)師也可據(jù)此提供更合理、更全面的產(chǎn)前診斷服務(wù)，適當(dāng)安撫地貧孕婦因過分擔(dān)心地貧可能導(dǎo)致的胎兒染色體異常所引起的焦慮，減輕地貧孕婦的心理負(fù)擔(dān)。