MicroRNA-7對膀胱癌診斷和復發的作用機制研究*

歐陽波，武明瑞，李家兵

[綿陽市第三人民醫院（四川省精神衛生中心） 泌尿外科，四川 綿陽 621000]

膀胱癌具有易復發、易轉移等特點，容易發生局部進展和遠處轉移。提高膀胱癌的診療水平，對其早期診斷和及時隨訪具有重大意義[1-5]。MicroRNA-7（miR-7）作為腫瘤研究的熱點因子，抑制受體激酶插入 嵌合 受 體（kinase insert domain-containing receptor,KDR）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）及 胰 島 素 樣 生 長 因 子（insulin like growth factor,IGF）等基因表達，在腫瘤發生、發展中miRNA發揮抑癌基因作用，其可調控多種腫瘤[6-7]。本研究旨在探討血清和尿沉渣miR-7用于膀胱癌診斷、預后及隨訪的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年12月—2015年12月綿陽市第三人民醫院收治的90例膀胱癌（膀胱癌組）、30例正常（正常組）、30例泌尿結石（泌尿結石組）及30例泌尿感染患者（泌尿感染組）病例資料。膀胱癌患者經病理組織學確診，均行診斷性電切或膀胱切除術，術后常規灌注吡柔比星或表柔比星，膀胱鏡檢1次/ 3個月。膀胱癌組：男性62例，女性28例；平均發病年齡（49.53±12.30）歲；TNM分期，Ⅰ、Ⅱ期35例，Ⅲ、Ⅳ期55例。正常組：男性15例，女性15例；平均年齡（46.59±12.96）歲。泌尿結石組：男性20例，女性10例；平均發病年齡（51.33±11.92）歲。泌尿感染組：男性19例，女性11例；平均發病年齡（50.66±10.35）歲。本研究通過本院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 樣品收集

分別于入院當日、治療后第2天及隨訪時采血。清晨空腹采集膀胱癌患者、正常、泌尿結石及泌尿感染患者靜脈血10 ml，2 000 r/min離心15 min，棄去血漿留取血清待檢。收集膀胱癌、正常、泌尿結石及泌尿感染患者晨起中段尿150 ml，2 000 r/min離心15 min，吸掉上清留取尿沉渣用于提取RNA。

1.3 實時聚合酶鏈反應

采用Trizol法提取血液和尿液內總RNA。用含有gDNA橡皮擦功能的PrimeScript RT試劑盒進行逆轉錄，合成cDNA進行并擴增，用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒按照說明書操作，進行實時聚合酶鏈反應（日本TaKaRa公司，大連寶生生物技術有限公司）。每個實驗重復≥3次，通過計算miR-7基因的相對表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA水平比較

4組患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，膀胱癌組患者血清和尿沉渣miR-7 mRNA表達下降（P＜0.05）。其他3組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 4組患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA水平比較（±s）

表1 4組患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA水平比較（±s）

組別 n 血清 尿沉渣正常組 30 1.00±0.00 1.00±0.00泌尿結石組 30 0.96±0.16 0.94±0.12泌尿感染組 30 1.02±0.12 1.01±0.16膀胱癌組 90 0.61±0.07 0.74±0.10 F值 71.510 37.820 P值 0.000 0.000

2.2 血清及尿沉渣miR-7的診斷價值

膀胱癌患者血清miR-7 AUC曲線下面積為0.82，敏感性為72.00%，特異性為80.00%；尿沉渣miR-7 AUC曲線下面積為0.89，敏感性為83.33%，特異性為86.67%。膀胱癌患者尿沉渣miR-7診斷價值優于血清miR-7（P=0.001）。見表2。

表2 血清及尿沉渣miR-7診斷價值分析

2.3 膀胱癌患者不同分期血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達水平比較

膀胱癌患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達水平比較，采用t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），TNM Ⅰ、Ⅱ期膀胱癌患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達高于TNM Ⅲ、IV期患者，即隨著膀胱癌患者TNM分期而加重。見表3。

表3 不同分期膀胱癌患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達水平比較（±s）

表3 不同分期膀胱癌患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達水平比較（±s）

分期 n 血清miR-7 mRNA 尿沉渣miR-7 mRNA I、II期 35 1.42±0.13 1.75±0.14 III、IV期 55 1.20±0.10 1.16±0.11 t值 7.347 18.272 P值 0.000 0.000

2.4 膀胱癌未復發與復發患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達水平比較

對90膀胱癌患者進行術后隨訪，隨訪時間（1.36±0.59）年，其中25例出現術后復發。膀胱癌未復發與復發患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），膀胱癌復發患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達較未復發患者下降。見表4。

表4 膀胱癌未復發與復發患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達水平比較（±s）

表4 膀胱癌未復發與復發患者血清及尿沉渣miR-7 mRNA表達水平比較（±s）

組別 n 血清miR-7 mRNA 尿沉渣miR-7 mRNA未復發 65 1.37±0.11 1.51±0.14復發 25 1.04±0.09 1.11±0.10 t值 12.720 13.360 P值 0.000 0.000

3 討論

目前診斷膀胱癌主要包括CT、MRI及B超等影像學檢查和膀胱鏡檢查、組織活檢及尿脫落細胞學檢查等[8-9]。B超作為膀胱癌篩選的主要手段，能檢測直徑≥0.5 cm的膀胱腫瘤，但極易受膀胱周圍組織的影響；CT和MRI價格昂貴，臨床多用于浸潤性膀胱癌的檢測，而對原位癌及微小腫瘤的檢測效果不佳，常導致腫瘤診斷的延誤治療甚至漏診；膀胱鏡檢查及組織活檢是臨床診斷的金標準，但具有創傷性，患者創口較大易感染，雖然尿脫落細胞學檢查特異性的較高，但其敏感性太差[10-11]。因此，尋找一種高效、方便、快捷的腫瘤標記物成為現如今膀胱癌早期診斷的重點。

miR-7其序列位于人類第9號染色體異源核糖核蛋白K基因的內含子區域，成熟miR-7產物序列高度的保守，可在不同調控網狀系統中及腫瘤內傳遞穩定[12-13]。研究表明，高表達的miR-7能抑制Pak1、VEGF及IGF1R等基因，而在人類乳腺癌、施萬細胞瘤、膠質瘤及舌鱗癌等多種腫瘤組織中呈低表達，說明其可調節起到多種腫瘤的發生發展，產生抑癌基因的功 能[14]。miR-7是新近發現的miRNA家族成員，其在多種惡性腫瘤中呈低表達，在抑制腫瘤細胞生長、侵襲、轉移中發揮重要作用。miR-7能夠通過作用于FAK基因的3′UTR區的特定位點對其表達進行負性調節，而影響腫瘤細胞遷移及侵襲。本研究結果表明，血清和尿沉渣miR-7在診斷的特異性及敏感性方面有優勢，并與膀胱癌TNM分期相關，這預示血清和尿沉渣miR-7可能作為判斷膀胱癌預后的無創診斷指標。血清和尿沉渣miR-7作為微創診斷指標，膀胱癌患者尿沉渣miR-7診斷價值優于血清miR-7，與膀胱癌術后復發相關，可用于指導術后膀胱鏡檢查的隨訪方案的制定。

綜上所述，血清和尿沉渣miR-7可用于作為診斷膀胱癌診斷、預后及隨訪的生物學腫瘤標志物，但血清及尿沉渣miRNA用于膀胱癌的臨床診斷尚需要進一步大樣本的前瞻性研究。