低氧環境對大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞表型轉化及MAPK信號通路相關蛋白表達的影響

陳思翔 趙凡 葉妙勇 朱晨鋒 趙劍鋒 黃曉軍

陰莖海綿體內氧含量與勃起功能有著密不可分的聯系。目前研究認為，低氧是勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）的一個獨立危險因子[1]。根治性盆腔手術（如根治性前列腺切除術）后患者常常會發生神經性ED，而低氧與其生理、病理變化有關[2]。有研究發現，因根治性前列腺切除術所致的ED，最主要的發病原因是海綿體神經（cavernous nerve，CN）損傷后，患者夜間生理性勃起受到影響，海綿體內組織缺氧，從而導致陰莖海綿體平滑肌細胞（corpus cavernosum smooth muscle cell，CCSMC）損傷和海綿體纖維化[3-4]。動物實驗發現，SD大鼠雙側海綿體神經切除后，CCSMC中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和膠原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）表達升高，CCSMC發生了缺氧和表型轉化[5]。一些有關ED發生機制的研究提示，MAPK信號通路在其中有著舉足輕重的地位[6]。但是，低氧狀態下CCSMC發生表型轉化與MAPK信號通路之間是否存在聯系，目前尚未可知。本研究通過低氧干預CCSMC，觀察低氧狀態下大鼠CCSMC表型轉化及MAPK信號通路相關蛋白表達的變化，以探討低氧環境對大鼠CCSMC表型轉化及MAPK信號通路相關蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠1只，6周齡，體質量170g。由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供，許可證號：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 主要試劑 DMED/F-12高糖培養液、FBS（美國Gibco公司），胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ（美國Sigma公司），4%多聚甲醛、Trtion X-100、異硫氰酸熒光素（SABCFITC）標記的羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶（HRP）（武漢博士德生物工程有限公司），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白定量試劑盒（杭州碧云天公司），兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、兔抗肌間線蛋白（Desmin）、兔抗 β-Actin（杭州華安生物技術有限公司），兔抗CollagenⅠ（美國Immunoway公司），兔抗細胞外信號調節激酶1和2（ERK1/2）及兔抗p-ERK1/2、兔抗p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及兔抗p-p38 MAPK、兔抗c-Jun氨基末端激酶（JNK）及兔抗p-JNK（美國Cell Signaling Technology公司），混合氣體1%O2＋5%CO2＋94%N2（杭州今工物資有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 CCSMC培養 采用酶消化法培養細胞[7]。采取頸椎脫臼法將SD大鼠迅速處死，置入75%乙醇中浸泡5min，轉移至無菌超凈臺中，迅速切取陰莖于無菌培養皿中，用4℃預冷的PBS沖洗陰莖組織2次。在PBS中去除龜頭部分，仔細剝除陰莖外周皮膚、白膜以及尿道海綿體、海綿體間隔和血管。PBS漂洗3次，剪成1mm×1mm×1mm的體積均勻的組織塊，然后放入含0.5%膠原酶Ⅰ溶液的1.5ml離心管中，置于37°C恒溫培養箱3～4h，使組織塊基本消化完畢。1 000r/min離心5min，棄上清液，在沉淀中加入1ml已配制好的含20%FBS的DMEM/F12高糖培養液，吹打均勻，移至細胞培養瓶，置于37°C、5%CO2培養箱中。培養24h后，鏡下可見貼壁生長的平滑肌細胞。當細胞生長融合達70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，然后換含10%FBS的DMEM/F12高糖細胞培養液培養。用于實驗的細胞均在4代以內。

1.3.2 CCSMC鑒定 采用免疫熒光法鑒定CCSMC[8-9]。按2×104/ml濃度將CCSMC鋪于24孔板中（24孔板中預先放入無菌圓型蓋玻片），置于37℃、5%CO2培養箱中培養24h，棄培養液，PBS洗3次，10min/次；加入4%多聚甲醛，4℃固定 15min，PBS 洗 3 次，10min/次；用0.5%Trtion X-100室溫破膜處理15min，PBS洗3次，10min/次；血清封閉液室溫封閉1h，分別加入兔抗α-SMA（1∶200）和兔抗 Desmin（1∶200）4℃過夜；PBS 洗 3次，10min/次，生物素化二抗（1∶100）置于 37℃恒溫培養箱避光孵育30min；PBS洗3次，10min/次，加入SABCFITC（1∶100）室溫避光孵育 2h；PBS 洗 3 次，10min/次，加入 DAPI（0.5μg/ml）室溫避光孵育 15min；PBS 洗 3次，10min/次，取出蓋玻片置于載玻片上，并用抗熒光衰減封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 細胞低氧處理 參照Wu等[10]提出的方法進行細胞低氧處理。按3×104/ml濃度將CCSMC鋪在6孔板中；待第2天細胞貼壁生長良好后換液；低氧組放入缺氧小室，通入混合氣體（1%O2＋5%CO2＋94%N2）；再將缺氧小室放入37℃恒溫培養箱中，低氧培養48h。同時常氧組置于37℃、5%CO2培養箱中培養48h。

1.3.4 CCSMC表型轉化及MAPK信號通路相關蛋白表達檢測 采用Western blot法。收集1.3.3培養的細胞，加入RIPA裂解液（含PMSF 1mmol/L），于冰上裂解30min，12 000r/min離心15min，取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴變性15min，用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白（80V，30min；120V，90min），然后切下含有目的蛋白條帶的凝膠條，采用濕轉法轉至PVDF膜上（分子質量較小：200mA，120min；分子質量較大：200mA，150min）。用 5%脫脂奶粉于搖床上室溫封閉2h，TBST搖床洗膜3次，10min/次；分別加入兔抗 α-SMA（1∶1 000）、兔抗 CollagenⅠ（1∶1 000）、兔抗 ERK1/2（1∶1 000）及兔抗 p-ERK1/2（1∶1 000）、兔抗 p38 MAPK（1∶1 000）及兔抗 p-p38 MAPK（1∶1 000）、兔抗 JNK（1∶1 000）及兔抗 p-JNK（1∶1 000）和鼠抗 β-actin（1∶1 000），4℃搖床孵育過夜。TBST 搖床洗膜3次，10min/次；分別對應加入兔抗和鼠抗二抗（1∶15 000），搖床室溫避光孵育2h，TBST搖床洗膜3次，10min/次。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統掃描，用Image J軟件對蛋白條帶進行半定量分析。所有實驗重復3次，以β-actin作為內參，計算HIF-1α、CollagenⅠ、α-SMA蛋白相對表達量；以β-actin為內參，計算 p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值，即p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK蛋白相對表達量。

1.4 統計學處理 應用SPSS 23.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCSMC鑒定結果 細胞分離培養第2天在顯微鏡下觀察到細胞貼壁生長良好，多數呈長梭形。選取4代內細胞進行免疫熒光鑒定，在熒光顯微鏡下觀察抗α-SMA和抗Desmin免疫熒光均為陽性，細胞核DAPI染色為藍色。將圖1中a與b融合得到c，d與e融合得到f，可觀察到大部分細胞，且細胞核與細胞質重合在一起，由此證明分離培養的細胞是同種細胞，即CCSMC。

圖1 CCSMC的免疫熒光鑒定（a：采用抗α-SMA免疫熒光染色；b：使用DAPI進行細胞核染色；c：a與b融合得到；d：采用抗Desmin免疫熒光染色；e：使用DAPI進行細胞核染色；f：d與e融合得到；免疫熒光，×100）

2.2 低氧干預48h后CCSMC的形態學變化 常氧條件下培養的CCSMC多呈長梭形，見圖2a；而經低氧干預48h后，CCSMC形態發生變化，主要表現為胞體趨向肥大，見圖2b。

圖2 常氧與低氧干預48h后CCSMC形態學觀察（a：常氧條件下；b：低氧條件下；倒置顯微鏡，×100）

2.3 低氧狀態下CCSMC表型轉化相關蛋白表達的變化 經低氧干預48h后，HIF-1α、CollagenⅠ蛋白相對表達量分別為0.23±0.04、0.49±0.07，較常氧組的0.12±0.01、0.29±0.04均明顯升高（均P＜0.05）；α-SMA 蛋白相對表達量為0.35±0.04，較常氧組的0.47±0.02明顯降低（P＜0.05），見圖 3。

2.4 低氧狀態下CCSMC MAPK信號通路相關蛋白表達的變化 經低氧干預48h后，p-JNK、p-p38 MAPK蛋白相對表達量分別為 0.27±0.05、0.38±0.28，較常氧組的0.42±0.09、0.58±0.27 均明顯降低（均P＜0.05）；p-ERK蛋白相對表達量為0.74±0.25，與常氧組的0.74±0.23比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

3 討論

CN損傷后會影響男性夜間生理性勃起，從而引起CCSMC損傷和海綿體纖維化；在這過程中，缺氧是關鍵[3-4]。相關研究表明，慢性缺氧性疾病，如動脈粥樣硬化、睡眠呼吸暫停綜合征、慢性阻塞性肺病等，可造成不同程度的夜間生理性勃起損害[11-13]。表型轉化，源自血管平滑肌細胞研究領域的概念，多次被用于闡述CCSMC表型轉化與ED關系的類推證據[14-16]。目前，國內外多個團隊正圍繞表型轉化與ED的關系展開一系列研究，國內以呂伯東團隊、韋安陽團隊為主。呂伯東團隊通過低氧干預CCSMC不同時間來觀察CCSMC發生表型轉化的變化規律，最終認為低氧干預48h是誘導CCSMC發生表型轉化最顯著的時間[17]。同時，呂伯東團隊還發現低氧干預48h后，低氧組表型轉化相關蛋白α-SMA表達較常氧組明顯下降，CollagenⅠ表達較常氧組明顯升高[18]。參考呂伯東團隊的前期實驗研究成果，本研究將CCSMC置于低氧中培養48h，結果發現低氧組α-SMA表達較常氧組明顯下降，HIF-1α、CollagenⅠ表達均明顯升高，這說明低氧干預能使CCSMC發生表型轉化，與呂伯東團隊的研究結果一致。

MAPK信號通路能調控細胞的各種基本生命活動，包括細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等。ERK1/2、JNK和p38（α、β、γ和δ）是MAPK家族的成員，與不同類型ED的生理、病理改變有著聯系[6]。Labazi等[19]在高血壓ED大鼠模型中發現二甲雙胍可以下調陰莖海綿體中p-ERK1/2水平。Lysiak等[20]通過損傷（完全切斷）和夾損傷（非完全切斷）小鼠陰莖CN，結果發現陰莖海綿體出現細胞凋亡，且伴有p-JNK、p-p38 MAPK水平升高。Abdel等[21]運用實時PCR法檢測糖尿病型ED大鼠的基因表達，結果發現p38基因表達明顯升高。本實驗結果顯示，原代培養的SD大鼠CCSMC在低氧處理48h后發生了表型轉化，同時p-ERK表達無明顯變化，p-JNK、p-p38 MAPK表達均明顯下降。

綜上所述，低氧誘導CCSMC發生表型轉化的同時，伴隨JNK、p38 MAPK信號的改變，但關于JNK及p38 MAPK信號在低氧所致CCSMC表型轉化過程中的具體調控作用尚不清楚。因此，筆者下一步將以p-JNK、p-p38 MAPK表達下調與低氧所致CCSMC表型轉化之間的相關性展開深入的研究，為臨床上治療神經性ED提供新思路。