甲氨蝶呤單用和聯合米非司酮對假孕家兔輸卵管的影響

韋偉 黃靈繡 宋光輝 李百加 鄒少晗

異位妊娠是一種常見的婦科疾病。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）作為一種抗有絲分裂活性的藥物，在異位妊娠早期保守治療中效果顯著。目前對MTX的研究一直偏向于異位妊娠保守治療療效和腫瘤化療后對卵巢、骨髓造血功能的損害上，對輸卵管影響的研究較少[1]。米非司酮為孕激素受體（progestrone receptor，PR）拮抗劑，主要通過抑制孕激素的作用改變子宮內膜容受性以及抑制排卵而達到抗早孕和避孕的目的。臨床上MTX聯合米非司酮應用于異位妊娠的早期保守治療一直存在爭議，其實際效果也有待商榷[2]。本研究從輸卵管收縮功能、形態學、雌激素受體（estrogen receptor，ER）及PR角度觀察不同劑量MTX單用和聯合米非司酮對假孕家兔輸卵管的影響，為MTX治療對后續妊娠的潛在影響提供實驗理論基礎，并探討米非司酮治療異位妊娠的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年雌性日本大耳白兔50只，體重（2.3±0.2）kg，月齡（4±0.3）個月，由浙江省實驗動物中心提供。普通實驗動物條件下飼養，置于室溫25℃，正常的晝夜光照。

1.2 試劑及儀器 人尿促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）針劑（75IU/支）、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）針劑（1 000IU/安瓿）購自麗珠集團麗珠制藥廠。MTX針劑（100mg/支）購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。米非司酮片（25mg/片）購自浙江仙琚制藥股份有限公司。兔抗人ER及PR單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術公司。自制Lock緩沖液：18g氯化鈉，0.84g氯化鉀，48g氯化鈣，0.3g碳酸氫鈉，2g葡萄糖，用去離子水定容至2 000ml，pH=7.4。張力換能器（規格：0～10g）、微調固定器購自北京新航興業科貿有限公司。MedLab生物信號采集處理系統（規格：四通道）購自南京美易科技有限公司。HSS-1（B）型恒溫浴槽購自成都儀器廠。SCM型雙層麥氏浴皿購自北京牧晨玻璃儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 假孕家兔模型制備及給藥方法 實驗前制作假孕模型[3]，采用隨機數字表法將50只家兔分為單用MTX 1mg/kg組、單用MTX 2mg/kg組、MTX 1mg/kg聯合米非司酮組、MTX 2mg/kg聯合米非司酮組和對照組5組，每組10只，于動情期肌肉注射HMG 50IU/kg，24h后再肌肉注射HCG 100IU/kg。于致假孕后第4天按照各自劑量一次性肌肉注射MTX；MTX聯合米非司酮各組另加喂米非司酮片（0.5mg/kg），研碎化水灌胃，早晚各1次，共3d；對照組僅一次性肌肉注射0.9%氯化鈉注射液2ml。

1.3.2 輸卵管收縮功能檢測 用藥結束1周后采用空氣栓塞法處死假孕家兔，立即剖腹。取一側輸卵管峽部長約1cm。張力換能器由微調固定器固定然后連接MedLab生物信號采集處理系統。輸卵管一端連接張力換能器，一端固定于麥氏浴皿底部，加入Lock緩沖液，從底部通入空氣，浴皿置于37℃恒溫浴槽之中。靜息狀態下先調零然后通過MedLab系統觀察輸卵管收縮頻率及幅度變化，時間為60min。收縮頻率是從收縮記錄圖上找出每次記錄區間內的所有收縮波，單位為次/30min；收縮幅度為每次收縮的最高點與最低點之間的差值，單位為mV。

1.3.3 輸卵管常規病理檢查 取另一側輸卵管壺腹部用10%甲醛固定，石蠟包埋，常規切片后HE染色，在光鏡下觀察各組形態學變化。

1.3.4 輸卵管壺腹部組織ER、PR表達檢測 采用SP免疫組化二步法：切片脫蠟后高壓修復，滴加過氧化氫甲醇液阻斷，室溫孵育，滴加一抗4℃冰箱過夜；復溫后滴加二抗，DAB顯色至顯微鏡下出現著色清晰、境界明確的棕黃色陽性產物，沖洗后蘇木素復染，PBS沖洗返藍；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。結果判斷：ER、PR定位于細胞核，每張切片在200倍光鏡下觀察5個視野，陽性細胞表達占30%為（＋），占50%以上為（＋＋＋），兩者之間為（＋＋），未見陽性細胞或只有極少數陽性細胞為（-），以PBS代替一抗作為陰性對照。ER、PR表達陽性率=ER、PR表達（＋＋＋）例數/總例數×100%。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況 假孕家兔模型建立成功，無一只死亡。與對照組相比，所有假孕家兔在MTX、米非司酮處理后的期間內均未觀察到明顯的異常行為，在實驗取材過程中，各組家兔輸卵管大體解剖均未發現明顯的肉眼改變。

2.2 各組輸卵管收縮功能比較 與對照組比較，各用藥組輸卵管收縮頻率均增快，收縮幅度均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；單用MTX兩組輸卵管收縮頻率和收縮幅度比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；與單用MTX兩組比較，聯合用藥兩組輸卵管收縮幅度均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1和圖1。

表1 各組輸卵管收縮功能比較

2.3 各組輸卵管壺腹部組織形態學變化 光鏡下可見對照組輸卵管黏膜纖毛及柱狀上皮完整（圖2a）；單用MTX 1mg/kg組輸卵管黏膜纖毛及間質輕度水腫（圖2b）；單用MTX 2mg/kg組輸卵管黏膜水腫，可見少量炎性細胞浸潤（圖2c）；MTX 1mg/kg聯合米非司酮組輸卵管黏膜纖毛及間質水腫，少量炎性細胞浸潤（圖2d）；MTX 2mg/kg聯合米非司酮組輸卵管黏膜纖毛及間質水腫明顯，炎性細胞浸及全層，并見少量嗜酸性粒細胞（圖2e）。

圖1 各組輸卵管收縮圖形，每一個波為一次收縮活動（a：對照組；b：MTX 1mg/kg 組；c：MTX 1mg/kg 聯合米非司酮組；d：MTX 2mg/kg組；e：MTX 2mg/kg聯合米非司酮組；收縮幅度以mV表示，每一格為1.2mV）

圖2 各組輸卵管壺腹部組織形態學變化（a：對照組；b：單用MTX 1mg/kg組；c：單用MTX 2mg/kg組；d：MTX 1mg/kg聯合米非司酮組；e：MTX 2mg/kg聯合米非司酮組；HE 染色，×100）

2.4 各組輸卵管壺腹部組織ER陽性表達率比較MTX 2mg/kg聯合米非司酮組較對照組ER陽性表達率下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余各用藥組與對照組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。各用藥組之間ER陽性表達率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 2和圖 3（插頁）。

2.5 各組輸卵管壺腹部組織PR陽性表達率比較MTX 2mg/kg聯合米非司酮組較對照組PR陽性表達率下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余各用藥組與對照組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。各用藥組之間PR陽性表達率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 3和圖 4（插頁）。

表2 各組輸卵管壺腹部組織ER陽性表達率比較（只）

3 討論

輸卵管由外向內一共分3層：漿膜層，平滑肌層（外層為縱肌層、內層為環肌層），黏膜層。輸卵管黏膜上皮為單層柱狀上皮，主要包含了纖毛上皮細胞和無纖毛上皮細胞，兩者的比例以及兩種細胞的高度與雌孕激素水平有關。雌孕激素及腎上腺素的多重調節引起輸卵管內層平滑肌蠕動以及外層平滑肌縱向運動，兩者的協同作用引起黏膜層纖毛上皮細胞規律擺動，從而起到輸送受精卵的目的[4]。本實驗因沒有理想的異位妊娠動物模型，故采用假孕家兔的輸卵管作為研究模型，同時采用的藥物劑量與臨床治療劑量基本相符，因而也能取得較好的一致性。

表3 各組輸卵管壺腹部組織PR陽性表達率比較（只）

圖3 各組輸卵管壺腹部組織ER陽性表達情況[a：ER陰性表達（-）；b：ER 陽性表達（+）；c：ER 陽性表達（++）；d：ER 陽性表達（+++）；免疫組化染色，×200]

圖4 各組輸卵管壺腹部組織PR陽性表達情況[a：PR陰性表達（-）；b：PR 陽性表達（+）；c：PR 陽性表達（++）；d：PR 陽性表達（+++）；免疫組化染色，×200]

MTX為葉酸類似物，通過抑制二氫葉酸還原成四氫葉酸，減少一碳單位形成，從而抑制DNA的合成和細胞能量代謝。臨床常用于異位妊娠的保守治療和腫瘤的化療。MTX治療對卵巢及骨髓造血功能的損害已有深入研究，但對后續妊娠的潛在影響尤其對輸卵管的影響研究甚少。有學者研究認為MTX會導致線粒體溶解，胞質空泡形成，纖毛的倒伏斷裂，這在一定程度上可導致不孕不育和異位妊娠[5-6]。低劑量下這種損傷在一定時間內可以部分恢復，若劑量＞5mg/kg，這種損傷則無法恢復[7]。本研究發現，注射MTX后輸卵管收縮頻率加快，收縮幅度下降，而劑量由1mg/kg增加至2mg/kg后輸卵管收縮活動并沒有產生明顯變化。這可能與MTX影響DNA、RNA的合成從而影響蛋白（肌動蛋白、肌球蛋白）的生成；損傷細胞誘發前列腺素釋放以及炎癥反應促白三烯和前列腺素的合成從而刺激輸卵管收縮頻率而抑制收縮活動有關[8-9]。另外MTX在低劑量（1mg/kg）時就會導致黏膜纖毛及間質水腫，炎性細胞浸潤，這種改變同MTX的劑量呈相關性。在觀察MTX對輸卵管壺腹部組織ER、PR陽性表達的影響時，筆者發現MTX 1mg/kg組、MTX 2mg/kg組和MTX 1mg/kg聯合米非司酮與對照組ER及PR陽性表達率比較差異均無統計學意義，這與本試驗最初的設想以及其他學者的研究略有出入，可能與樣本量過少有關。

米非司酮為PR拮抗劑，可競爭性結合PR和腎上腺素受體，通過拮抗孕激素改變子宮內膜容受性和抑制排卵達到抗早孕及避孕的目的。目前對米非司酮的研究偏向于抗孕激素治療，如治療子宮腺肌癥、子宮肌瘤等，而對輸卵管本身的影響研究較少[10]。王莉芬等[11]報道米非司酮在轉錄和翻譯水平抑制PR的合成，下調ER含量，在增生期和分泌期輸卵管ER、PR表達率相對較高，妊娠期較非妊娠期表達明顯下降。與子宮內膜相比，輸卵管部位ER、PR表達更低[12-13]。本研究發現MTX劑量一定的情況下添加米非司酮后較單用MTX輸卵管收縮頻率無變化，但收縮幅度下降，并且可在組織學水平加重MTX對輸卵管組織的損傷。此外與對照組比較，MTX 2mg/kg聯合米非司酮組ER、PR陽性表達率明顯降低，而MTX 1mg/kg聯合米非司酮組與對照組ER、PR陽性表達率比較差異均無統計學意義。由此提示MTX達到一定劑量（2mg/kg）時，其聯合米非司酮的確可以下調ER、PR的表達。

綜上所述，MTX可以對輸卵管的活動產生一定的抑制作用，并可以對輸卵管組織學造成一定損傷，且這種損傷與劑量呈相關性，而米非司酮可以增強MTX的上述作用。當MTX達到一定劑量時，其聯合米非司酮會對輸卵管ER、PR的表達起到抑制作用，在較低劑量（1mg/kg）時，這種作用不明顯。因而在臨床使用MTX治療異位妊娠或行腫瘤化療時應盡可能減少劑量，因其可能會增加后續異位妊娠或不孕癥的發生概率。米非司酮在治療異位妊娠時，不但增加了MTX對輸卵管的損傷及抑制，而且在輸卵管部位抗孕激素、抗早孕的作用弱，增加了內出血的風險，因而其輔助治療異位妊娠的理論依據不夠充分，需慎重使用。