塵螨抗原對P815肥大細胞維生素D受體和炎癥介質分泌的影響及 1,25（OH）2D3的免疫調節作用

李如霞 白小莉 俞棋英 孫妍 李巧玲 李孟榮

機體對過敏原的易感性是引起過敏性疾病的重要危險因素，近幾十年世界各地過敏性疾病發生率呈逐年增長趨勢[1]。塵螨抗原（Der p）是誘發過敏性哮喘和鼻炎最常見的室內過敏原[2]。肥大細胞作為免疫系統的中間細胞及效應細胞，主要分布于與外界過敏原密切接觸的組織表面，并在過敏性疾病的發病機制中發揮核心作用[3]。1,25（OH）2D3是維生素D的活性形式，有研究報道能下調登革熱病毒感染的巨噬細胞Th2型細胞因子IL-4的表達，高劑量1,25（OH）2D3能上調IL-10分泌[4]。目前關于1,25（OH）2D3對肥大細胞生物學作用的研究甚少。本研究通過觀察Der p以及1,25（OH）2D3聯合Der p直接作用于P815肥大細胞后維生素D受體（VDR）表達及 IL-4、IL-10分泌的變化，探討1,25（OH）2D3的免疫調節作用。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 CO2培養箱（Heal Force 90，美國Thermo），RT-PCR儀（美國Roche），電泳槽（Dycp-31BM，北京市六一儀器廠），生物電泳圖像分析（FR-980），倒置顯微鏡（日本NIKON），熒光顯微鏡（日本OLYMPUSCX21FS1），圖像分析軟件（美國Image-Pro plus 6.0）。小鼠肥大細胞瘤細胞P815（中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心），純化塵螨提取液（有效成分Der p，丹麥ALK-Abello），1,25（OH）2D3（美國Sigma）；抗維生素D受體抗體（ab3508，英國Abcam），異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），高糖培養基（DMEM）、FBS（美國Gibco），RT-PCR 試劑盒（美國 Fermentas），Trizol抽提試劑、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）（美國 Invitrogen），核苷酸膠體染料（SYBR Green I Stain）（美國 Roche），核酸染色劑（Gold View）、蛋白定量試劑盒（BCA）（中國 SalarBio），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（美國 Bioworld），小鼠IL-4、IL-10 ELISA試劑盒（杭州聯科生物MULTI SCIENCES）；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由上海基康生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 細胞培養與分組 P815肥大細胞置于含10%FBS的DMEM培養基，并放入37℃、5%CO2培養箱中隔天傳代一次。計數2×105/ml細胞并培養24h后，分別用Der p（0、0.000 1、0.001、0.01、0.1μg/ml）及 1,25-（OH）2D3（10-12、10-10、10-8mol/L） 單獨或聯合作用 P815 肥大細胞，其中聯合作用分組情況如下：0μg/ml Der p+0mol/L 1,25（OH）2D3為Ⅰ組，0.1μg/ml Der p 為Ⅱ組，0.1μg/ml Der p+10-12mol/L 1,25（OH）2D3為Ⅲ組，0.1μg/ml Der p+10-10mol/L 1,25（OH）2D3為Ⅳ組，0.1μg/ml Der p+10-8mol/L 1,25（OH）2D3為Ⅴ組；分別于 2、6、12、24、36h終止反應，室溫離心10min后收集上清液，置于-80℃保存備用。

表1 引物序列

1.3 免疫熒光細胞染色及瓊脂糖凝膠電泳驗證P815肥大細胞上表達VDR （1）免疫熒光細胞染色：小鼠肥大細胞經4%多聚甲醛固定15min后，PBS洗5min，Triton-X 100穿孔 15min，PBS洗 5min×3次，用 5%BSA 封閉30min，加入1%BSA稀釋的一抗，放入濕盒，4℃過夜，PBS洗5min×3次，加入1%BSA稀釋的熒光二抗，置于 37℃避光孵育 60min，PBS洗 5min×3次，制片，在熒光顯微鏡下觀察肥大細胞VDR表達。（2）瓊脂糖凝膠電泳：配制2%的瓊脂糖凝膠，膠膜中放好梳子，將凝膠倒入膠膜中，室溫下靜置30min，使膠充分冷卻并凝固，移去梳子，將凝膠放入電泳槽。加入0.5×TBE電泳緩沖液，使液面高出凝膠約1mm，取需檢測基因PCR產物4μl，加入5×上樣緩沖液1μl充分震蕩混勻，加入加樣孔中，留出一孔加入 DNA Marker 5μl，120V恒壓電泳，使DNA向陽極方向泳動。40min后停止電泳，取出凝膠，用FR-980生物電泳圖像分析系統獲取凝膠圖像。

1.4 肥大細胞中VDR mRNA表達的檢測 采用RTPCR法。收集培養的肥大細胞，使用Trizol Reagent提取細胞總RNA，使用多功能酶標儀測定RNA含量及純度。根據RT-PCR試劑盒說明書進行cDNA合成，逆轉錄條件如下：42℃ 1h，72℃ 5min。每個反應體系包括5μl的 SYBR Green I Stain，1μl的 10μmol/L 引物，1μl的cDNA，加雙蒸水至總體積為10μl；擴增條件：95℃10min，95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s；共 45 個循環；反應結束后用Roche Light Cycler 480軟件進行數據分析，目標基因表達差異以經過處理的樣本相對于未經處理的樣本的倍數表示，即檢測基因的差異=2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt未處理組）。

1.5 肥大細胞中VDR蛋白表達的檢測 采用Western blot法。收集培養的肥大細胞，用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離VDR蛋白，濕式電轉移進行轉膜，再以5%%脫脂奶粉室溫封閉2h，4℃搖箱中一抗孵育過夜，一抗濃度 1∶1 000，等滲緩沖溶液（TBST）洗 5min×3次，室溫下孵育二抗2h，二抗濃度1∶5 000，TBST洗15min×3次，滴加化學發光檢測試劑，用Gel-Pro凝膠分析軟件分析。蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶累積光密度/內參條帶累積光密度。

1.6 肥大細胞上清液中IL-4、IL-10濃度的檢測 采用ELISA法。使用小鼠IL-4、IL-10 ELISA試劑盒檢測上述實驗收集的肥大細胞懸液上清液中IL-4、IL-10濃度，按說明書進行操作。

1.7 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VDR在P815肥大細胞上的表達 免疫熒光細胞染色及瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，P815肥大細胞上表達VDR，見圖1（插頁）和圖2。

圖1 免疫熒光細胞染色驗證P815肥大細胞上表達VDR（a：不加VDR單克隆抗體；b：加VDR單克隆抗體，綠色熒光為陽性表現；c-d：DAPI染色后顯示的細胞核；×400）

圖2 P815肥大細胞上VDR表達的電泳圖

2.2 Der p對P815肥大細胞VDR表達的影響 不同濃度 Der p 作用 P815 肥大細胞 2、6、12、24、36h 后，VDR mRNA表達均有不同程度下降，在12、24h作用組，VDR mRNA表達呈濃度依賴性下降（均P＜0.05），見圖3。不同濃度Der p作用P815肥大細胞36h后，VDR蛋白表達呈濃度依賴性下調，見圖4。

圖3 不同濃度Der p作用P815肥大細胞2、6、12、24、36h后VDR mRNA表達

2.3 1,25（OH）2D3對P815肥大細胞VDR表達及IL-4、IL-10分泌的影響 與0mol/L組比較，10-12、10-10mol/L的1,25（OH）2D3作用后P815肥大細胞VDR mRNA表達差異均無統計學意義（均P＞0.05）；10-8mol/L的1,25（OH）2D3作用后P815肥大細胞VDR mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與0mol/L組比較，10-12mol/L的1,25（OH）2D3作用后 P815肥大細胞VDR蛋白表達差異不明顯；10-10mol/L、10-8mol/L的1,25（OH）2D3作用后P815肥大細胞VDR蛋白表達均明顯上調，見圖5。不同濃度1,25（OH）2D3作用P815肥大細胞36h后，IL-4濃度變化不明顯（P＞0.05）；而10-10mol/L、10-8mol/L 的 1,25（OH）2D3作用后 P815 肥大細胞上清液中IL-10濃度較0mol/L組均明顯升高（均P＜0.05），見圖 6。

圖4 不同濃度Der p作用P815肥大細胞36h后VDR蛋白表達的電泳圖（a：0μg/ml；b：0.0001μg/ml；c：0.001μg/ml；d：0.01μg/ml；e：0.1μg/ml）

2.4 Der p聯合1,25（OH）2D3作用P815肥大細胞36h后對VDR表達及IL-4、IL-10分泌的影響 與Ⅰ組比較，Ⅱ組P815肥大細胞VDR mRNA表達明顯下降（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組P815肥大細胞VDR mRNA表達均明顯升高（均P＜0.05）。Ⅱ組P815肥大細胞VDR蛋白表達較Ⅰ組明顯下調；Ⅱ組與Ⅲ組P815肥大細胞VDR蛋白表達變化不明顯；Ⅳ、Ⅴ組P815肥大細胞VDR蛋白表達明顯上調。與Ⅰ組比較，Ⅱ組P815肥大細胞上清液中IL-4濃度明顯升高（P＜0.05），IL-10濃度差異無統計學意義（P＞0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組P815肥大細胞上清液中IL-4濃度均明顯下降（均P＜0.05），且 1,25（OH）2D3濃度越高，IL-4濃度下降越明顯，而IL-10濃度差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖7-8。

圖5 不同濃度1,25（OH）2D3作用P815肥大細胞36h后VDR mRNA 及蛋白表達（a：0mol/L；b：10-12mol/L；c：10-10mol/L；d：10-8mol/L）

圖6 不同濃度1,25（OH）2D3作用P815肥大細胞36h后上清液中 IL-4、IL-10濃度變化（n=6）

圖7 Der p聯合1,25（OH）2D3作用P815肥大細胞 36h后VDR mRNA及蛋白表達

圖8 Der p聯合1,25（OH）2D3作用P815肥大細胞36h后上清液中 IL-4、IL-10濃度變化（n=6）

3 討論

過敏性疾病包括支氣管哮喘、變應性鼻炎、變應性結膜炎、變應性皮炎、食物及藥物過敏等，目前關于過敏的產生機制尚未完全闡明，但是過敏原和易感個體的存在以及兩者之間的相互作用是導致過敏性疾病發生必不可少的因素。肥大細胞是過敏反應的效應細胞，在先天性和獲得性免疫應答中也發揮著重要作用。

國內研究結果顯示，引起人類變態反應性疾病的塵螨主要包括屋塵螨和粉塵螨，其抗原有多種亞型，不同Der p具有交叉反應性，Der f1和Der p1均能誘導交叉反應和產生種屬特異性抗體[5-6]。針對Der p2和Der f2的IgE抗體，幾乎呈完全交叉反應；而且Der p2和Der f2在塵螨過敏性疾病患者皮試陽性中占極高的比例[7]。有文獻證明，Der f直接作用于P815肥大細胞，可以導致其表達 TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-9 和 IL-13 增加[8]。本研究結果發現，不同濃度Der p作用于P815肥大細胞不同時間后，VDR mRNA及蛋白表達均減少，但無明顯濃度及時間依賴性變化，低濃度Der p對VDR表達的影響不明顯。0.1μg/ml Der p作用于P815肥大細胞36h后，上清液中IL-4濃度明顯升高，但IL-10濃度無明顯變化。因P815肥大細胞不表達IgE受體I（FcεRI），且本實驗未加入Der p特異的IgE抗體，故以上結果表明Der p對肥大細胞的直接作用可能是通過下調VDR表達，促進IL-4的分泌，破壞Th1/Th2平衡，導致了Th2型免疫應答增強，從而發揮其致炎作用。

Th1/Th2平衡是免疫應答調節中的關鍵環節，Th1和Th2彼此相互抑制，呈動態平衡；如果這一平衡向Th2偏移，會使Th2型細胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13等）水平升高，而Th1型細胞因子（如IL-12、INF-γ等）水平降低[9]。IL-4是主要的抗原類別轉換因子，其可以引導被抗原激活的B淋巴細胞IgE抗體的產生增加，而IgE依賴的肥大細胞的激活在速發型超敏反應中起核心作用[10]。IL-4還可以促進組織肥大細胞及嗜酸性粒細胞增長[11]。此外，IL-4可以激活并且維持Th2細胞對過敏原的應答反應。本研究結果發現，0.1μg/ml Der p處理P815肥大細胞36h后，IL-4濃度較對照組明顯升高，提示Der p可通過促進肥大細胞IL-4分泌，促進Th2型免疫應答的產生。IL-10是一種具有強抗炎作用的細胞因子，因其可抑制Th1和Th2免疫應答，故其對免疫介導的各種疾病，包括過敏性疾病、移植排斥反應以及自身免疫性疾病等具有潛在的治療作用[12-13]。IL-10通過調節Th1/Th2型細胞因子的分泌、減少IgE的產生、誘導機體對過敏原產生免疫耐受等途徑減輕過敏性炎癥反應[9]。已有研究結果發現，外周血衍化的CD3+、CD4+T細胞在1,25（OH）2D3作用下，IL-10 分泌呈濃度依賴性增加[14]。

維生素D通過它的活性形式1,25（OH）2D3發揮作用，其不僅對骨鹽代謝有調節作用，也能調節先天性和獲得性免疫應答[15]。近幾十年來，很多動物實驗和臨床研究證實維生素D在治療過敏性疾病中的有效性。最近一項臨床研究結果顯示，補充維生素D可以明顯改善患兒的濕疹癥狀[16]。補充維生素D的哮喘小鼠，其氣道高反應、氣道重塑以及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細胞數和前炎癥細胞因子均明顯減少，而BALF中IL-10濃度及T調節細胞數明顯增多[17]。脂多糖可以誘導小牛樹突狀細胞IL-10的分泌，而維生素D對其有促進作用[18]。

本研究對細胞懸液上清液中IL-4、IL-10濃度的檢測結果顯示，不同濃度1,25（OH）2D3作用P815肥大細胞36h后，IL-4濃度無明顯變化，而IL-10濃度較對照組明顯升高，且1,25（OH）2D3濃度越大，IL-10濃度升高越明顯。0.1μg/ml Der p處理P815肥大細胞36h后，IL-4濃度較對照組明顯升高，但IL-10濃度與對照組比較差異無統計學意義。將1,25（OH）2D3、Der p同時處理P815肥大細胞36h后，IL-4濃度較Der p處理組明顯下降，且1,25（OH）2D3濃度越高，IL-4濃度下降越明顯。可見，Der p單獨作用于P815肥大細胞可增加IL-4的分泌，但對IL-10水平無明顯影響；1,25（OH）2D3單獨作用于P815肥大細胞對IL-4水平無影響，但可增加IL-10的分泌，并抑制Der p的促IL-4釋放作用；而Der p可抑制1,25（OH）2D3的促IL-10釋放作用。筆者認為，1,25（OH）2D3對Der p引起的肥大細胞炎癥反應的干預作用可能是通過抑制IL-4的合成和分泌，從而抑制Th2型免疫應答的。

綜上所述，Der p直接作用于P815肥大細胞，使VDR表達下調及IL-4分泌增加，對IL-10分泌無明顯影響；高濃度1,25（OH）2D3單獨作用可上調VDR表達及促進IL-10分泌，但對IL-4分泌無明顯影響；1,25（OH）2D3可以下調Der p引起的IL-4分泌，從而抑制Th2免疫應答；1,25（OH）2D3可通過上調肥大細胞VDR表達，促進IL-10分泌，從而發揮抗炎作用。關于1,25（OH）2D3對肥大細胞VDR表達的調節及引起細胞因子分泌的機制，目前尚不能完全解釋清楚，有待進一步研究。