囊型包蟲病患者Th9細胞相關因子mRNA表達特點研究*

陳 媛，龐楠楠，趙 驍，趙 慧，安夢婷，閆 芳，張峰波，丁劍冰△

(1.新疆醫科大學基礎醫學院，新疆烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊市中醫醫院檢驗科，新疆烏魯木齊 830000)

包蟲病主要由兩種絳蟲可引發人包蟲病：細粒棘球絳蟲(Eg)引發人囊型包蟲病(CE)，多房棘球絳蟲(Em)引發人泡型包蟲病(AE)[1]。在中國，以上兩種類型包蟲病的患病率在全球屬于最高水平，在國內主要分布于西北五省、西藏、四川等地，新疆是高發區之一。

2008 年VELDHOEN等[2]和DARDALHON等[3]同時報道了在白細胞介素(IL)-4和轉化生長因子(TGF)-β同時存在的情況下可誘導初始CD4+T 細胞分泌IL-9、IL-10，并將之命名為“Th9”細胞。Th9細胞主要分泌IL-9和IL-10細胞因子，且有其特異的轉錄因子富含嘌呤盒1(PU.1)和干擾素調節因子-4(IRF-4)[4-6]。作為新型輔助性T細胞，Th9在大量動物實驗及在人體內作用的研究已成為近年熱點，但Th9細胞相關因子在囊型包蟲病患者疾病的發生發展過程中的具體機制尚不清楚。本研究擬通過檢測CE患者外周血中IL-9、PU.1、IRF-4和IL-4 mRNA表達水平，初步探討Th9細胞相關因子在細粒棘球蚴感染后機體免疫應答中所起可能作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集2015年8月至2017年8月在新疆醫科大學第一附屬醫院就醫和入院的與納入標準相符的CE患者33例作為CE組，且這33例CE患者就診前未接受任何治療，其中男性19 例，女性14 例，年齡19～58 歲，中位年齡30歲；對這33例CE患者經過外科手術和阿苯達唑藥物治療，跟蹤6個月，通過影像學檢查未發現復發和轉移，且沒有明顯感染癥狀的33例CE患者作為治療后組(PCE組)；30例性別、年齡與患者相匹配新疆醫科大學第一附屬醫院的體檢健康的員工作為健康對照組(HC組)。納入標準：按照包蟲病診斷標準并通過患者病史、影像學檢查以及體格檢查確診為囊型包蟲病的患者，并經手術、病理檢查證實。排除標準：使用抗炎藥；合并其他疾病的患者，如急慢性病毒感染、自身免疫性疾病、腫瘤、風濕性疾病、膿毒血癥、嚴重上呼吸道感染、高熱、膽囊炎、肺炎、其他寄生蟲疾病等。

1.2儀器與試劑 總RNA 提取試劑盒購自 Qaigen 公司，逆轉錄反應試劑盒購自SYBER GREEN公司，實時定量試劑盒購自 TaKaRa公司 ；實時熒光定量PCR儀；電泳儀及凝膠自動成像系統、xMark全波長酶標儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1引物設計 按照Gen Bank 中人 β-actin、 IL-9、PU.1、IRF-4和IL-4 mRNA引物序列，以β-actin作為參照基因，全部引物均由大連寶生物工程有限公司合成，引物基本信息詳見表1。

表1 引物序列及擴增長度

1.3.2總RNA的提取和cDNA的合成 于早晨用枸櫞酸鈉抗凝管采集每位研究對象空腹靜脈血5 mL。外周血總RNA的提取按照Qaigen 公司提供的試劑盒說明書進行，從每個外周血標本中取 1 μg 總RNA作為模板，然后在依據SYBER GREEN公司的反轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。

1.3.3實時熒光定量PCR(QRT-PCR)檢測IL-9、PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA表達 依據TaKaRa 公司的實時定量試劑盒說明書在冰上配制PCR 反應液，每一個樣本重復3 次，待反應結束后得到一條熒光擴增曲線及溶解曲線。使用標準品已知起始拷貝數的對數值作為橫坐標，以測得的循環閾值(Ct)作為縱坐標，做出標準曲線。將β-actin作為參照基因，選用2-ΔΔCt相對定量法來確定特定熒光域值對應循環數的 Ct 值，對目標基因定量，來分析對比各組中IL-9、PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA基因表達差異。

2 結 果

2.1IL-9 mRNA在HC組、CE組及PCE組外周血中的相對表達水平 CE 組IL-9 mRNA的表達水平(0.098±0.044)明顯高于HC組(0.075±0.038)，差異有統計學意義(P<0.05),稍高于PCE組(0.078±0.044)，差異無統計學意義(P>0.05)，IL-9 mRNA在PCE組和HC組的表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：與HC組比較，aP<0.05

圖1 IL-9 mRNA在HC組、CE組及PCE組中相對表達量

2.2PU.1 mRNA在HC組、CE組及PCE組外周血中的相對表達水平 CE 組 PU.1 mRNA的表達水平(0.104±0.067)明顯高于HC組(0.052±0.008)，差異有統計學意義(P<0.05)，且明顯高于PCE組(0.065±0.035)，差異有統計學意義(P<0.05),PU.1 mRNA在PCE組和HC組的表達沒有明顯差異(P>0.05)。見圖2。

注：與HC組比較，dP<0.01 ；與CE組比較，bP<0.05

圖2 PU.1 mRNA在HC組、CE組及PCE組中相對表達量

2.3IRF-4 mRNA在HC組、CE組及PCE組外周血中的相對表達水平 IRF-4mRNA在CE組(0.070±0.020)和PCE組(0.067±0.018)的表達較HC組(0.060±0.013)增高不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)，且IRF-4mRNA在CE、HC組、PCE組的表達水平沒有明顯的差異(P>0.05)。見圖3。

圖3 IRF-4mRNA在HC組、CE組及PCE組中相對表達量

2.4IL-4 mRNA在HC組、CE組及PCE組外周血中的相對表達水平 IL-4是CD4+T細胞亞群分化為Th9細胞亞群的重要的上游刺激因子，IL-4mRNA在CE組的表達水平(1.053±0.317)明顯高于HC組(0.125±0.03)和PCE組(0.53±0.047)，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：與HC組比較，dP<0.01；與PCE組比較，eP<0.01

圖4 IL-4mRNA在HC組、CE組及CE組中相對表達量

注：A為IL-9 mRNA和PU.1 mRNA相對表達量之間的相關性；B為IL-9 mRNA和IRF-4 mRNA相對表達量之間的相關性;C為IL-9 mRNA和IL-4mRNA相對表達量之間的相關性

圖5 IL-9 mRNA和PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA相關性分析

2.5IL-9 mRNA和PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA相關性分析 為了探討 IL-9和PU.1、IRF-4、IL-4 之間的關系，本研究用Spearman線性相關性分析法進行上述因子的相關性分析，結果顯示，IL-9與轉錄因子PU.1、上游誘導因子IL-4mRNA均呈正相關(PU.1：r=0.974,P<0.000 1；IL-4：r=0.922,P<0.000 1)；IL-9與另一轉錄因子IRF-4 mRNA沒有相關性(r=0.261，P=0.142)，見圖5。

3 討 論

細粒棘球蚴在宿主體內生長發育緩慢，可使機體出現炎性反應和免疫反應，感染初期的臨床癥狀并不明顯，感染數月乃至數年后才出現突出的臨床癥狀[7]。人感染細粒棘球蚴后，宿主體內會發生一系列細胞免疫和體液免疫的變化，當前認為這些變化中最重要的是CD4+T 細胞亞群對機體感染免疫應答的調節過程。在大多數感染免疫中，許多研究都認為Th1/Th2起著重要的作用。有研究證實，感染細粒棘球蚴初期機體的免疫反應以Th1型細胞免疫為主，Th1細胞及其分泌的細胞因子有利于機體清除寄生蟲，因此在包蟲病感染免疫中對機體起到保護性作用；但在感染中晚期隨著絳蟲的寄生和其對宿主免疫的主動調節，宿主逐漸向Th2體液免疫反應類型轉變。由于Th2細胞分泌的細胞因子對Th1細胞有抑制作用，可削弱宿主機體保護性免疫應答，從而使病原體逃避宿主免疫系統的攻擊，有利于寄生蟲在宿主體內繼續寄生[8-9]。 之前認為Th1/Th2和Th17/Treg 平衡學說是包蟲病的免疫學機制中的主要部分[10-12]，以前的研究中將IL-9歸于Th2類細胞，其可作用于多種靶細胞，參與發病機制完全不同的疾病，如過敏性疾病、自身免疫性疾病、寄生蟲感染等[13-15]。現有研究發現，IL-9是Th9細胞產生的，作為新型輔助性CD4+效應性T細胞，Th9細胞在許多疾病中發揮著重要的作用[4,16-17]，本課題組前期工作研究證實Th9/IL-9可能參與了細粒棘球蚴感染的免疫應答反應過程[18-20]。但在囊型包蟲病中，Th9細胞因子mRNA水平上的表達特點研究尚處于空白，本研究顯示IL-9 mRNA在囊型包蟲病患者中的表達明顯高于健康人群，但經過外科手術和藥物治療成功的患者IL-9 mRNA表達水平并沒有顯著減少。其結果提示在細粒棘球蚴感染機體后，寄生蟲可能刺激宿主發生免疫應答反應并上調Th9細胞功能性細胞因子IL-9 mRNA表達，PCE組IL-9 mRNA表達水平變化特點的可能原因是其他IL-9轉錄因子開始生效或者在轉錄水平延遲表達，但其具體機制尚需進一步研究。

目前有研究證實，Th9細胞主要由兩種途經產生：一是初始CD4+T細胞在體外IL-4和TGF-β聯合刺激誘導下直接分化而來；另一個是在TGF-β單獨作用下由Th2細胞轉化產生[21]。在研究中，IL-4 mRNA在囊型包蟲病患者外周血中的表達明顯高于健康人群，而且治療成功后其表達水平明顯減少，與HC組沒有統計學差異。此結果提示IL-4 作為Th9 細胞分化的上游因子可能參與CE患者的感染免疫途徑并起到一定的作用并且可能是CE預后相關因子，IL-4可能會削弱Th1細胞在CE患者體內的保護性免疫機制并使寄生蟲在體內繼續存活。

PU.1、IRF-4是Th9細胞的特異性轉錄因子，其中PU.1作為ETS轉錄因子家族成員之一，可與IL-9 基因的啟動子直接結合，誘導IL-9的表達，此過程在其他CD4+T細胞亞群中未見，僅見于Th9 細胞。體外培養實驗證實，若小鼠PU.1缺乏，其IL-9表達也極少，如果Th9 細胞中PU.1 的表達上調，相應的IL-9表達也會增加。在本研究中也發現CE患者外周血中PU.1 mRNA的表達明顯增加，同時在PCE組明顯降低。而另一轉錄因子IRF-4 mRNA在CE患者外周血中的表達增加不明顯，且治療后PCE組變化也不明顯，和HC組比較均沒有明顯差異。此結果提示轉錄因子PU.1在CE患者感染免疫過程中對Th9細胞分化增殖的調節起到一定的作用，而IRF-4可能在過程中沒有明顯的作用。

本研究中IL-9和PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA相關性分析結果顯示，IL-9與轉錄因子PU.1、IL-4之間存在明顯的正相關關系，與另一轉錄因子IRF-4之間沒有相關性。因此，隨著Th2細胞發揮其在囊型包蟲病中晚期主導作用，Th9/IL-9也可能在CE患者感染免疫的發生和發展過程中起一定的作用，PU.1、IL-4 mRNA在治療后下降提示在寄生蟲對機體的免疫刺激清除后，CE患者體內的感染免疫反應機制也可能發生改變。

4 結 論

本研究顯示Th9細胞的相關因子IL-9、PU.1、IL-4 mRNA 在CE患者外周血中的表達顯著上調，在治療后PU.1、IL-4 mRNA表達水平基本恢復正常，提示Th9細胞可能參與了細粒棘球蚴感染過程中的免疫應答和調控機制。但是Th9細胞在囊型包蟲病中的感染免疫的具體機制有待進一步明確。