荔枝DA1同源基因的克隆及生物信息學分析

王 弋，董 晨，魏永贊，鄭雪文，李偉才

(中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091)

【研究意義】荔枝起源于我國，是嶺南地區的特色水果，因其甜美的風味和豐富的營養深受消費者的歡迎。但是大部分荔枝品種果核大，影響食用口感及商品價值。‘妃子笑’是目前產量最大的荔枝品種，具有果大核小的優點，因此對‘妃子笑’果核發育相關的基因進行分析，有助于理解荔枝果核發育的分子機制，為今后利用生物技術定向改良果核性狀提供基因資源。【前人的研究進展】利用分子生物學及遺傳學的方法，科學家已在擬南芥和水稻等植物中鑒定了多個調控種子大小的基因如DA1，GS3，GW7，DEP1等[1-4]。其中DA1是一個重要的種子大小調控基因，該基因編碼一泛素受體。擬南芥中的研究發現，該基因突變后種子和器官大小顯著增加，細胞學觀察結果發現DA1通過抑制珠被細胞的增殖控制種子大小[5]。蛋白序列分析表明，DA1蛋白具有兩個泛素受體典型的ubiquitin interaction motifs (UIM)和一個single zinc-binding(LIM)結構域。生化實驗表明，DA1蛋白與E3連接酶DA2存在直接的蛋白互作，推測DA1通過DA2識別并降解特異底物。此外，DA1與UBP15也存在直接的相互作用，并且通過影響其蛋白穩定性調控種子大小[5]。DA1不僅影響種子大小，調控該基因的表達水平還能夠提高作物產量。在油菜中，下調DA1同源基因BnDA1的表達能夠顯著增加種子大小，提高種子產量及生物量[6]；而在玉米中，通過上調突變形式DA1的表達水平也可增加產量并增強淀粉的合成[7]。這表明DA1在作物生產中具有重要的利用價值，但目前該基因在荔枝中并未見報道。【本研究切入點】根據前期RNA-seq數據，預測荔枝DA1的同源基因。利用生物信息學軟件分析3個基因及其編碼蛋白的序列特征。【擬解決的關鍵問題】分析荔枝DA1蛋白的保守結構域及其進化關系，為進一步研究荔枝DA1基因的生物學功能提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以荔枝種質資源圃種植的16年樹齡、樹勢較壯的‘妃子笑’荔枝結果樹為實驗母樹。取雌花謝花后50 d果實中的果核為實驗材料，果核以液氮處理，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 基因序列的獲得

根據前期RNA-seq數據，分析鑒定荔枝LcDA1基因轉錄本，利用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)的Open Reading Frame Finder在線軟件分析荔枝LcDA1的開放閱讀框[1]。

1.3 蛋白理化性質分析

利用ProtParam網站(http://web.expasy.org/protparam/)，對荔枝DA1蛋白的相對分子量、氨基酸數量及理論等電點等理化性質進行分析。

1.4 蛋白質二級結構預測

蛋白二級結構利用PredictProtein (https://www.predictprotein.org/)在線平臺進行分析。

1.5 結構域分析

使用EBI數據庫的interProScan功能(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)對荔枝LcDA1蛋白保守結構域進行分析。

1.6 進化樹分析

利用AlignX軟件對利荔枝LcDA1蛋白以及來自油菜、擬南芥、玉米等物種的DA1蛋白進行多重序列比對，并利用MEGA 6.06軟件的neighbor-joining工具進行系統進化樹的構建。

2 結果與分析

2.1 荔枝LcDA1基因的鑒定及序列分析

根據前期RNA-seq數據，對擬南芥DA1的同源基因進行進行鑒定，并在種子cDNA中進行擴增。鑒定到3個荔枝DA1同源基因，分別命名為LcDA1-1，LcDA1-2和LcDA1-3。3個基因轉錄本長度分別3039、2525和2187 bp，ORF長度分別為1419、1479和1104 bp。3個荔枝DA1同源基因的信息列于表1。

2.2 荔枝LcDA1蛋白理化性質分析

利用ProtParam網站，對3個荔枝LcDA1的理化性質進行分析。結果顯示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3蛋白分子式分別為C2347H3606N670O709S36、C2436H3775N683O773S33和C1807H2756N514O553S32，相對分子量分別為53706.67、56055.86和41554.79，理論等電點分別為5.89、5.16和6.46，不穩定系數分別為68.83、69.84和56.10(表2)。

2.3 荔枝LcDA1基因與DA1的序列相似性比較

利用Vector NTI軟件的Alignx工具，對荔枝LcDA1-1，LcDA1-2和LcDA1-3基因及擬南芥DA1基因堿基及氨基酸序列進行比對，分析不同DA1基因及編碼蛋白之間的相似性。結果顯示在堿基和蛋白水平LcDA1-1和LcDA1-2具有較高的相似性，而與LcDA1-3的相似性較差(表3)。這與LcDA1-3在C末端較LcDA1-1和LcDA1-2缺少100多個蛋白相關。

表1 荔枝LcDA1基因的基本特征

表2 LcDA1蛋白理化性質分析

表3 荔枝LcDA1與擬南芥DA1基因及編碼蛋白相似性分析

2.4 荔枝LcDA1基因保守結構域分析

為了分析LcDA1的蛋白結構，利用EBI數據庫的interProScan功能對LcDA1蛋白的結構域進行分析。結果顯示在LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3蛋白均具有LIM-type鋅指結構域[8-9]；LcDA1-1、LcDA1-2還有2個與泛素互作的基序UIM1和UIM2[10]。這些保守基序及結構域暗示LcDA1蛋白具有與DA1蛋白相同的功能(圖1)。

2.5 荔枝LcDA1二級結構分析

利用predictprotein對LcDA1的二級結構進行預測。結果顯示LcDA1-1由27.54 %的α-螺旋，8.69 %的β折疊及63.70 %的無規則卷曲組成；LcDA1-2由28.05 %的α-螺旋，6.10 %的β折疊及65.85 %的無規則卷曲組成；LcDA1-3由16.08 %的α-螺旋，7.36 %的β折疊及76.57 %的無規則卷曲組成(表4)。

2.6 荔枝LcDA1進化樹分析

將擬南芥DA1蛋白序列在NCBI中進行Blast檢索，獲得多個物種的DA1同源蛋白序列并下載(圖2)。物種包括水稻(Oryzasativa)，醉蝶花(Tarenayahassleriana)，月季(Rosachinensis)，蘿卜(Raphanussativus)，桃(Prunuspersica)，梅(Prunusmume)，櫻桃(Prunusavium)，毛果楊(Populustrichocarpa)，桑樹(Morus notabilis)，木薯(Manihotesculenta)，錦葵(Herraniaumbratica)，棉花(Gossypiumhirsutum)，野草莓(Fragariavesca)，山萮菜(Eutremasalsugineum)，桉樹(Eucalyptusgrandis)，番木瓜(Caricapapaya)，甘藍(Brassicaoleracea)，油菜(Brassicanapus)。不同物種中的DA1同源蛋白序列以MEGA 6.06軟件進行分析，并構建系統進化樹。結果顯示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3分別于不同的植物聚類在一起，其中LcDA1-1與番木瓜的進化關系最近，LcDA1-2和LcDA1-3與水稻的進化關系最近。

圖1 LcDA1蛋白保守結構域分析Fig.1 Conserved domains of LcDA1 protein

表4 蛋白二級結構

3 討 論

DA1編碼一類泛素受體蛋白，受體蛋白既能夠識別游離泛素，也能夠識別被泛素化的底物[11-12]，擬南芥中的研究發現該基因參與調控植物種子大小。擬南芥DA1蛋白編碼532個氨基酸，包含2個泛素作用結構域(UIM)和1個鋅指結構域(LIM)。在育種中DA1也表現出很好的應用潛力，有研究表明調控油菜和玉米中通過調控DA1同源基因的表達水平可顯著增加產量和生物量[6-7]。

本研究在荔枝中鑒定到3個DA1同源基因(LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3)，基因編碼蛋白長度分別為473、493和368個氨基酸。生物信息分析表明LcDA1-1、LcDA1-2編碼蛋白與擬南芥DA1蛋白的相似性達到58.6 %和53.0 %。而LcDA1-3與擬南芥DA1相似性偏低，僅有27.9 %，這與LcDA1-3相比擬南芥DA1缺少164個氨基酸相關。雖然蛋白相似性并不是非常高，但LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3均具有典型的LIM結構域，而LcDA1-1和LcDA1-2還具有UIM結構域，這表明LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3確為擬南芥DA1的同源基因。UIM是泛素受體重要的保守結構域，其能夠作為接頭與泛素化底物相互作用，并將底物引導至降解的位置。生化實驗發現，UIM中的UIM2負責與泛素和E3泛素連接酶結合[13]。LIM也是一類保守的結構域，其包含鋅指串聯結構域，為特異的蛋白互作提供平臺[14-15]。LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3基因編碼蛋白中關鍵結構域的保守性也表明其在進化中受到嚴格的選擇，也暗示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3具有與擬南芥DA1蛋白類似的生物學功能。

圖2 荔枝和21種植物LcDA1蛋白系統進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of LcDA1 protein in litchi and 20 other plants

進化樹分析表明，LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3并未聚類在一起，而是分別與不同植物的DA1蛋白聚類在一起，這表明LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3已經出現了一定的分化。LcDA1-1與來自熱帶果樹番木瓜的進化關系最近，LcDA1-2和LcDA1-3與水稻的OsDA1聚類在一起。

4 結 論

本研究利用轉錄組測序數據，在荔枝中鑒定了3個DA1同源基因的全長序列。生物信息學分析結果顯示3個基因的編碼蛋白均含有DA1蛋白典型的LIM結構域，暗示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3具有保守的蛋白功能。本研究為利用DA1基因調控荔枝種子大小，從而改善荔枝果實品質改良提供了重要基因資源。