山地草地土壤微生物群落對土壤養分的指示作用

金章利，劉高鵬，周明濤，許文年

(1.湖北三峽職業技術學院，湖北 宜昌 443000；2.湖北金源綠通生態環境工程有限公司，湖北 宜昌 443000；3.三峽大學土木與建筑學院，湖北 宜昌 443002)

【研究意義】對于整個生態環境而言，陸地和海洋占據著主體，其孕育著數不勝數的動植物資源，尤其是陸地，更是人類生產生活的不可缺少的載體[1]，人類為了維持基本的生活，會在陸地種植大量的糧食作物等，長期對土地的利用和開發，自然對土壤產生了深遠的影響[2]。作為絕大多數陸生植物生長的載體，其肥力和活性不僅受到土壤養分和水分的影響，同時也受到微生物的作用，不同的微生物種群具有不同的降解和分解速率，其活動規律和新陳代謝也發生較大的差異，腐殖質和有機質的分解離不開其分解作用，從而將有機質等轉化為能夠被土壤植被利用的土壤養分，進而維持植株生長發育[3-4]。作為土壤生態的重要一環，微生物的新陳代謝等活動直接決定著土壤物質和能量交換及循環，維持著整個土壤養分的動態轉換及循環，常常被作為土壤肥力的體現指標之一[5]。一旦生態環境發生較為明顯的改變，其中的環境因子則會隨之發生相應的變化，土壤微生物亦是如此，在土壤生態不斷變化的過程中微生物活動也隨之改變，不僅微生物能夠通過分解和轉換有機質等維持土壤養分循環，同時土壤養分也在反哺著微生物[4]。【前人研究進展】劉文高[6]通過大量研究發現，微生物活動能夠明顯地影響著土壤養分轉化，不僅能夠維持土壤肥力，而且能夠通過分解腐殖質等加速土壤生態循環，對生態起著調節作用；越來越多的研究認為，微生物不僅僅是扮演著“分解者”的角色，同時更是土壤能量及物質循環的“交換者”。王迎春[7]通過對植物、土壤和微生物三者進行研究得知，三者共同組成了一個局部的生態循環，微生物的分解及降解作用有利于土壤肥力和活性的保持，而土壤活性及肥力顯著影響著植物生長發育，反過來講，植物生長過程中的枯枝落葉等腐殖質能夠為微生物提供分解物質來源，因此三者存在明顯的相互作用。微生物群落特點常用多樣性來表示，這是其穩定性的表現，代表著其生命體征[8]。王新平等[9]對土壤相關的水分、生物量及植株特征等方面開展了實地研究，通過研究得知微生物在灌木林的生長過程中起著重要的作用。王曉龍等[10]將鄱陽湖濕地土壤作為研究對象，對微生物量開展了一系列研究，并從地表及土壤兩個方面開展相應生物量對比。由于研究手段和方法有限，多數研究側重于微生物量的研究[11-12]，而近年來其多樣性研究也不斷加深，這主要得益于生物分析技術的進步[13-14]，不僅從物種方面開展相應研究，更從其功能及遺傳方面的多樣性開展一系列探究，從而更加豐富了土壤微生物多樣性研究[15]。【本研究切入點】我國具有較為遼闊的國土面積，南北跨度較大，因此具有較為復雜的氣候特點和地形地貌，就喀斯特地貌而言，我國分布面積最廣，且主要分布于西南地區[16]；該地區不僅地形復雜，且生態環境脆弱，僅略強于寒漠地區生態[17]；對于喀斯特地貌而言，其地上及地下的地形景觀存在巨大差異，形成了獨特的二元地貌特點，地上及地下相互聯系、關系緊密，同時又相互制約，這也造就了典型差異的地上及地下生物群落分布[17-18]。由于其地形復雜、地勢連綿，因此不僅存在多樣性明顯的生物資源，同時體現出較大差異的生境高度，造就了植被分布的多樣性，也形成了微生物分布的多樣性。該地區分布較多的是峽谷，崎嶇的地表加之陡峭的山坡，在雨水及風力等作用下，地表侵蝕較為嚴重，該區域的土壤層較薄，難以形成較強的蓄水能力，因此土壤難以為植被生長提供必須的充足養分，故該地區植被分布較為稀疏，且生長緩慢，其植被生態受到很大的制約，整個局部生態缺乏穩定性和抗逆性，無較強的自我修復能力[19]，此外，近年來不合理的開發利用更加劇了該區域生態水平退化[20]。由于該地區脆弱的生態已經深深影響到當地的生活，因此越來越多的學者開展了相關的研究，不僅從土壤及植被的角度來探究該區域地貌特點，而且從耕種等方面開展相應研究[21]。【擬解決科學問題】本研究在以往學者研究的基礎上，將喀斯特山地草地作為研究對象，分析土壤及微生物之間的關系，以為該地區生態保護提供有益借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本實驗將貴州省睛隆縣作為研究對象，通過分析所選實驗區域的喀斯特地形地貌來探究土壤與微生物之間的關系，該研究區域內超過一半面積為喀斯特地形，且分布較多的高原峽谷，因此不僅山高，而且谷深、坡陡，呈現典型的山巒起伏，并形成了較大差距的海拔，其最高、最低海拔相差近1500 m，受所處位置的影響，該區域呈現明顯的亞熱帶季風氣候，且雨熱處于同季節，此外，因該區域地勢起伏較大，因此氣候特點具有明顯的垂直分布性，在山谷之處較為干熱，而高原之處氣溫較低，不僅出現了一山分四季的特點，而且呈現十里不同天的景象。

該區域近年來的降雨量近1650 mm，擁有近15 ℃的年均氣溫，日照達到近1500 h，全年的無霜期達到320 d，呈現典型的降雨充足且光熱充分，但是由于土壤養分較弱，土層較薄，土壤的養分及含水量難以充分滿足植被生長，因此植被以山地草地及喬木等為主；該區域自然災害多發，巖溶等現象明顯，因此喀斯特地貌特征顯著[16-17]。

1.2 試驗設計

1.2.1 樣地設置 本研究將山地草地作為研究植被，在實驗過程中采取典型樣地法，實驗開始于2015年，并進行連續3年的實地研究，最終將平均采樣數據作為最終的研究數據加以分析。首先在實驗區域內隨機選擇3個長寬均為100 m的樣地，要求間隔達到100 m；之后在各樣地內設置長寬均為100 cm的小樣方20個，要求樣方具有典型的喀斯特地貌特點；然后對草地物種進行統計，并做好記錄。本研究要求取樣土壤坡度在5°以內，且海拔較為接近，這樣能夠減少實驗誤差。

1.2.2 土壤樣品的測定 對樣方土壤取樣采用四分法進行，首先在各樣方取出1 kg土壤，取樣深度最大為40 cm，將土樣混合均勻后帶回實驗室；之后進行長達20 d的風干，以備后續進行養分測定。

借助于元素分析儀來對全碳及氮含量分析，對速效磷、鉀含量分析分別利用比色法、光度計法進行[22]。

1.2.3 土壤微生物群落功能多樣性 多樣性分析所用數據需要在Biolog-Eco下進行72 h的溫育處理，之后將等同于10 g烘干土壤的土樣加入NaCl溶液，濃度為0.145 mol·L-1，振蕩30 min，然后將其中的100 μl接種于Eco板后讀數，25 ℃培養216 h，并每隔12 h讀一次數；之后，在NaCl溶液中進行稀釋后進行恒溫培養，并做好吸光值記錄。

通過分析其對碳源的反應情況來探究微生物對碳源的利用水平，在研究中常用平均每孔顏色變化率AWCD來表示，該值越大說明其具有較高的微生物豐度[18-19]。

AWCD=Σ[(Ci-R)/31]

公式中，Ci、R分別表示第i孔、對照孔的吸光值。

H=-∑Pi(lnPi)

式中，Pi為第i孔的相對吸光值比值。

Pi=(Ci-Ri)/∑(Ci-Ri)

S=被利用碳源的總數

Ds=1-∑Pi

Excel 2007.0和SPSS 18.0進行數據統計和方差檢驗，以平均值±標準誤差表示(Mean±SE)，單因素方差分析(One-way ANOVA)，Pearson相關系數法檢驗各指標之間的相關性，所有原始數據進行對數轉換；變量的顯著性經過的蒙特卡洛(Monte Carlo)檢驗(499次)，CANOCO 4.5分析土壤養分對微生物多樣性與環境因子的響應。

2 結果與分析

2.1 喀斯特山地草地土壤養分季節動態特征

由表1可知，喀斯特山地草地土壤養分具有明顯的“表聚性”，從垂直方向來看，土壤pH變化范圍為7.01～7.87，pH隨著土層深度的增加逐漸增加，其中30～40 cm土層pH顯著高于其他土層(P<0.05)，表層土層pH最低(P<0.05)；土壤全碳變化范圍為10.14～15.23 g·kg-1，土壤隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層土壤全碳顯著高于其他土層(P<0.05)，20～30和30～40 cm土層土壤全碳差異不顯著(P>0.05)；土壤全氮變化范圍為1.07～1.54 g·kg-1，土壤隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層土壤全氮顯著高于其他土層(P<0.05)，20～30和30～40 cm土層土壤全氮差異不顯著(P>0.05)；土壤全磷變化范圍為1.01～1.12 g·kg-1，土壤隨著土層深度的增加逐漸降低，其中不同土層土壤全磷差異均不顯著(P>0.05)；土壤全鉀變化范圍為35.79～46.32 g·kg-1，土壤隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層土壤全鉀顯著高于其他土層(P<0.05)，10～20和20～30 cm土層土壤全鉀差異不顯著(P>0.05)；土壤堿解氮和速效磷變化范圍為42.19～53.06和26.54～35.13 mg·kg-1，土壤隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層土壤堿解氮和速效磷顯著高于其他土層(P<0.05)，20～30和30～40 cm土層土壤堿解氮和速效磷差異不顯著(P>0.05)。

2.2 喀斯特山地草地土壤微生物數量

由表2可知，桂西北喀斯特山地草地土壤微生物數量及組成不同，其中以細菌數目最多，占到90 %以上。土壤細菌數目變化范圍為7.56×105～13.02×105，隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層土壤細菌數目顯著高于其他土層(P<0.05)，20～30和30～40 cm土層土壤細菌數目差異不顯著(P>0.05)；土壤真菌數目變化范圍為3.21×104～7.23×104，隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層土壤真菌數目顯著高于其他土層(P<0.05)，20～30和30～40 cm土層土壤真菌數目差異不顯著(P>0.05)；土壤放線菌數目變化范圍為5.18×104～9.56×104，隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層土壤放線菌數目顯著高于其他土層(P<0.05)，10～20和20～30 cm土層土壤放線菌數目差異不顯著(P>0.05)；土壤微生物總數目變化范圍為6.58×106～9.12×106，隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層土壤微生物總數目顯著高于其他土層(P<0.05)，10～20和20～30 cm土層土壤微生物總數目差異不顯著(P>0.05)。

表1 喀斯特山地草地土壤養分垂直分布

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note： Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).

2.3 喀斯特山地草地土壤微生物群落多樣性

微生物群落多樣性指數可用來指示土壤微生物群落利用碳源的程度，根據培養第100 小時的AWCD值計算土壤微生物群落的物種豐富度指數(H)、均勻度指數(E)、優勢度指數(Ds)和碳源利用豐富度指數(S)。結果表明，不同土層深度土壤微生物群落功能多樣性指數存在一定差異，其中物種豐富度指數(H)變化范圍為1.58～3.25，隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層物種豐富度指數顯著高于其他土層(P<0.05)，10～20和20～30 cm土層物種豐富度指數差異不顯著(P>0.05)；均勻度指數(E)變化范圍為0.62～0.98，隨著土層深度的增加逐漸降低，其中0～10 cm土層均勻度指數顯著高于其他土層(P<0.05)，20～30和30～40 cm土層均勻度指數差異不顯著(P>0.05)；優勢度指數(Ds)變化范圍為0.58～0.67，隨著土層深度的增加逐漸增加，不同土層優勢度指數差異均不顯著(P>0.05)；碳源利用指數(S)變化范圍為8.74～20.36，隨著土層深度的增加逐漸降低，不同土層優勢度指數差異均顯著(P<0.05)。

表2 土壤微生物種群數量垂直分布

表3 土壤微生物群落多樣性垂直分布

表4 土壤養分與微生物多樣性之間相關性

注：*，**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。

Note： *, ** mean significant difference at the level of 0.05 and 0.01, respectively.

表5 土壤微生物數量與微生物多樣性之間相關性

2.4 土壤養分與微生物多樣性之間相關性

土壤養分為土壤微生物的重要碳源和氮源，為探討土壤養分與土壤微生物群落多樣性之間的關系，進行了土壤養分與微生物群落多樣性相關性分析(表4)。土壤微生物群落功能多樣性各指標與土壤pH之間存在負相關關系，與土壤養分等均呈正相關關系，其中土壤微生物群落功能多樣性各指標均與土壤有效養分呈極顯著正相關(P<0.01)；物種豐富度指數(H)和碳源利用豐富度指數(S)與土壤養分各指標和微生物數量的相關系數絕對值均高于優勢度指數(Ds)和均勻度指數(E)，說明土壤養分和微生物數量對土壤微生物群落優勢度指數和均勻度指數的影響作用較小。由此可知，土壤養分和微生物數量與微生物群落功能多樣性密切相關，其中土壤pH對土壤微生物群落功能多樣性貢獻為負，土壤養分對土壤微生物群落功能多樣性貢獻為正，這是造成不同土層土壤微生物群落多樣性差異的重要原因，其中全碳和全氮是土壤微生物的主要養分來源。

2.5 土壤微生物群落多樣性與土壤養分和微生物量的典范相關分析

將喀斯特山地草地土壤微生物指標分成3組變量，其中，土壤養分(全碳、全氮、全磷、全鉀、速效磷、速效氮、速效鉀)構成第1組變量，土壤微生物數量(細菌、真菌和放線菌)和土壤微生物多樣性分別構成第2、3組變量。用典范相關分析來研究土壤微生物群落多樣性與土壤養分和微生物數量之間的關系(表6)，土壤養分、土壤微生物數量均與土壤微生物群落多樣性具有顯著的相關性，其中，土壤微生物數量對微生物群落多樣性的貢獻最大(其相關系數絕對值最大)。

環境因子在微生物群落分布中起著重要的作用，水熱及地形地貌等都會對微生物分布及其活動產生直接作用，在微生物群落分布對比研究中常用冗余分析RDA來探究二者之間的關系，環境因子會影響土壤的分布和特性，而土壤作為微生物活動的基本載體之一，受到土層厚度及養分的制約，此外，環境的不同會產生不同的植被分布，不同的植被產生的枯枝落葉等凋落物不同，這將直接影響著土壤有機質的含量，進而影響微生物的分解作用；可以說環境因子的復雜性導致了微生物群落分布的復雜性，為了從多個方面分析環境因子對微生物活動的綜合作用，本實驗過程中通過RDA方法來探究環境與微生物之間的關系，其中的響應變量是微生物多樣性，其中的解釋變量有2個：一是土壤養分，二是微生物數量；通過這種研究分析方法，微生物及環境因子排序能夠直觀地顯示在一個圖上(圖1)，這樣更直觀地展現不同的環境因子所產生的不同影響，箭頭象限代表著相關性，箭頭長度代表相關程度，其夾角越大則說明其相關性越弱；通過對比發現，就RDA排序圖而言，前2個排序軸的累積解釋率達到了56 %，而第1個因子解釋率達到37 %，且通過了顯著性統計檢驗，因此可以說該部分環境因子對微生物產生顯著的制約作用。除了土壤pH值之外，微生物多樣性越豐富，土壤養分含量越充足，二者之間存在明顯的正相關關系；在土壤養分指標不斷增加的情況下，微生物豐富度呈現明顯的上升，其中相關性最大的是全碳及全氮，這是微生物分布的最主要影響因子；另外，pH值越大，土壤越容易出現板結等問題，其肥力和活性明顯下降，因此不利于微生物活動，也就是二者呈現顯著負相關。

表6 土壤微生物群落多樣性與土壤養分和微生物量的典范相關分析

圖1 土壤微生物與與土壤養分的RDA排序Fig.1 RDA sequence diagram of soil microorganisms and soil nutrients

3 討 論

不同的微生物群落，其對碳源的利用能力也會出現較大差異，這主要是其群落分布數量及功能等方面存在較大差異，在微生物研究過程中常常使用豐度及多樣性指數開展相應的研究。Shannon指數基于顏色變化率的基礎上開展微生物對碳源的利用能力，主要側重于功能方面，該指數越大的情況下則說明微生物能夠利用更多種類的碳源、且利用效率更高，該指標是一種正向的表示[23]；Mc-Intosh指數主要是對物種均一分布特性方面的研究，當微生物對碳源利用量更大、利用種類更多的情況下，該指數也越大，這也是一種正向的表示[24]。Simpson指數更多地反映的是碳源嗜好。均勻度指數能夠在多樣性指數的基礎上通過計算而得，這主要受到兩個方面的影響：第一，微生物分布的種類，也就是豐度，第二，該微生物分布是否呈現均勻分布；微生物的種類越多，也就意味著其具有更明顯的多樣性，其分布更均勻的情況下能夠增加其分布數量，也就是提升了多樣性。通過對第96小時的AWCD值進行計算可知微生物主要分布在表層土壤，且分布較為均勻，種類最多。

微生物能夠將腐殖質等有機質進行分解及降解，從而使之能夠轉化為土壤養分以供植物吸收利用，這樣形成了土壤肥力和養分；另一方面，微生物活動也需要必要的養分以維持其新陳代謝等活動，該部分養分主要來源于土壤，因此來說二者關系密切，為分析二者之間的相關程度，本研究開展了相關性分析，通過分析得知，土壤pH不斷升高的情況下，微生物分布反而減少，說明二者存在顯著負相關，這表明微生物不適宜在過高pH狀態下生長發育；而碳、氮等土壤養分不斷增加的情況下，微生物分布種類更多且更均勻，說明二者存在明顯的正相關關系，其中有效養分與微生物功能多樣性之間在0.01檢驗水平下達到顯著正相關；與優勢度指數相比而言，豐度、均勻度指數與土壤養分的相關系數更高，說明土壤養分對豐富度及均勻度產生更大的作用。綜合來看，除了pH之外，土壤養分對微生物分布產生多方面的制約作用，且是正向的影響作用，其中全碳及全氮的影響最大，這也是不同的土壤類型其微生物分布也存在顯著差異的原因之一。土壤環境因子能夠顯著影響微生物分布，不同的植被分布也對微生物活動產生明顯的制約作用，從中不難看出，環境因子的復雜性使得微生物分布也具有很大的復雜性。

由于西南地區廣布喀斯特地貌，脆弱的生態環境已經深深影響到當地居民的生活，日益惡化的生態已經引起人們的充分重視，治理石漠化工作一直在不斷推進，退耕還草還林面接不斷增多，該區域脆弱的生態在慢慢恢復[25]。隨之而變的是土壤養分及微生物，該地貌常常會發生巖化作用，這巖石風化等過程中會產生大量的次生礦物，大量的養分會從這些礦物中釋放，在微生物的分解作用下形成土壤養分，從而明顯改善土壤肥力，同時對土壤理化特性起著改善作用，進而為植被生長提供更加良好的土壤條件，促進植被生長發育，同時利于微生物活動，增強微生物的群落分布豐度和均勻度[26]；植物在生長過程中難免發生枯枝落葉，這些凋落物經過微生物的分解及降解，能夠被轉化為被植株利用的土壤養分，從而維持著土壤的物質交換和能量循環，在提升土壤肥力和活性方面作用顯著，從另一方面來講，凋落物也會微生物活動提供了必需的養分[16-18]。土壤養分的轉化離不開微生物的分解作用，而分解速率等受到其群落分布的制約，因此微生物分布與土壤特性存在密不可分的關系，二者相互影響、相互作用，共同維持土壤生態環境[21]。通過研究發現，在土壤深度不斷加深的情況下，微生物分布數量及土壤養分明顯減少，下層土壤的養分明顯低于表層土壤，且二者存在顯著差異，在0.05檢驗水平下顯著；但就全磷而言，土層深度對其并無顯著影響，主要原因在于磷具有很強的沉積性，具有穩定的存在形式[5-6]。地表枯枝落葉等凋落物能夠在微生物分解下轉化為土壤養分，這些腐殖質等有機質主要在地表進行分解，但是在淋溶等作用下部分有機質進入下層土壤，但是微生物主要分布在表層土壤區域，且有機質主要集中在表層土壤，因此表層土壤更具有充足的養分；深層土壤不僅缺乏充足的腐殖質等有機質，同時無充足的微生物分布，因此深層土壤有機質分解速度較慢[26-27]。

4 結 論

桂西北喀斯特山地草地土壤養分隨著土層深度的增加逐漸降低，具有明顯的“表聚性”，不同土層土壤全磷差異均不顯著(P>0.05)，土壤微生物以細菌數目最多；土壤細菌、真菌、放線菌數目隨著土層深度的增加逐漸降低。物種豐富度指數、均勻度指數、碳源利用豐富度指數均隨著土層深度的增加而降低，不同土層碳源利用豐富度指數差異均顯著(P<0.05)。相關性分析表明土壤養分、土壤微生物數量均與土壤微生物群落多樣性具有顯著的相關性，其中，土壤微生物數量對微生物群落多樣性的貢獻最大(其相關系數絕對值最大)。不僅土壤養分受到微生物多樣性影響，而且微生物數量也與其多樣性之間存在密切關系，且具有顯著相關性。通過RDA分析可知，微生物多樣性分布的最主要環境因子不僅有全碳，還有全氮，這些環境因子同時也是土壤養分的主要成分，這說明不僅微生物分解作用關乎土壤養分的積累，同時土壤養分也能夠為微生物活動提供必需的養分支撐，二者密切影響，如何探究多種環境因子對微生物群落分布的影響，也是下一步研究的方向之一。