益氣養陰活血方對糖尿病腎病大鼠腎功能及足細胞的影響

應帥兵張伊娜邱華鋒黃平

1.浙江中醫藥大學 杭州 310053 2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）又稱糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病的慢性微血管病變的主要并發癥之一，可導致終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）、腎功能衰竭[1-2]，是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。腎小球臟層上皮細胞又稱足細胞,是一種終末分化的多突狀細胞，參與了腎小球毛細血管袢的穩定，在維持腎小球濾過屏障，調節超濾系數以及保持腎小球基底膜的正常形態中起重要作用。DN病理改變表現為腎小球基底膜增厚、足細胞足突廣泛融合甚至消失、足突裂孔數量減少、系膜區細胞外基質的進行性積聚，這主要與腎小球內灌注壓的增加、各種血管活性激素途徑和氧化應激的激活、糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）誘導的病理改變、多元醇通路活化及細胞因子損傷等機制有關[3]。研究表明，足細胞形態學變化涉及到蛋白尿的發生以及腎臟疾病的發展[4]，因此保護足細胞對于控制DN病情以及防止疾病發展意義重大。

厄貝沙坦片為血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）受體拮抗劑，臨床上廣泛用于合并高血壓的2型糖尿病患者的治療。研究證明，厄貝沙坦能顯著抑制腎小球系膜基質的沉積，抑制足細胞數量減少，減輕腎小球足細胞和基底膜的病理變化，從而保護足細胞，減輕DN的腎功能損傷[5]。中醫認為糖尿病屬消渴病，主要病機是脾腎氣陰兩虛、瘀血阻滯，以本虛標實為主要特點，益氣養陰、活血化瘀是DN最重要的治則之一，因此化瘀通絡中藥是DN的基礎用藥。益氣養陰活血方是以益氣養陰活血為治則制成的經驗方[6]，既往臨床研究表明，益氣養陰活血方可以改善DN患者腎功能，減輕機體炎癥反應，緩解腎損傷[7]，其作用機制與控制糖脂代謝、抑制腎臟纖維化、抗氧化有關[8]。尹娟娟等[9]研究提示，益氣養陰活血方能夠增加巨蛋白表達，但該方是否對腎組織足細胞形態學變化存在影響，尚未見文獻報道。本研究以腹腔注射鏈脲佐菌素（strepotozotocin，STZ）溶液的方法制備DN大鼠模型，以益氣養陰活血方進行干預，同時以厄貝沙坦為陽性對照，觀察大鼠腎功能指標及足細胞的形態變化，進一步探究益氣養陰活血方對DN大鼠腎臟的保護作用靶點和機制，為益氣養陰活血方的進一步推廣應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 5周齡清潔級健康雄性SD大鼠32只，體質量（body weight,BW）為（200±20）g，購自上海斯萊克有限公司 [實驗動物生產許可證：SCXK（滬）2017-0005]，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心[實驗動物使用許可證：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠全封閉隔離飼養，室溫20℃，相對濕度40%～60%，每日光照12h。

1.2 主要試劑與儀器 益氣養陰活血方由黃芪20g、麥冬 15g、白術 12g、五味子 15g、知母 12g、山萸肉12g、桃仁 12g、紅花 10g、茯苓 15g、玄參 15g、旱蓮草15g、川芎12g、女貞子15g、葛根15g組成，以上藥物均購于浙江中醫藥大學名中醫館，由浙江中醫藥大學中藥飲片廠提供，水煎濃縮至5g·mL-1；厄貝沙坦片購于賽諾菲(杭州)制藥有限公司（規格：150mg/片，國藥準字：J20130049)，以無菌蒸餾水配置成2.5mg·mL-1的混懸液；STZ購于美國Sigma公司（批號：SLBB8126V），以0.1mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，調節pH至4.2～4.5，配成1%STZ溶液，使用時應現用現配，避免冰浴中操作；血清肌酐（serum creatinine,SCr）檢測試劑盒、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所（批號：20180314、20180321）。羅氏血糖儀為德國羅氏公司產品；7020全自動生化分析儀及H-7650日立透射電子顯微鏡均為日本日立公司產品。

1.3 方法

1.3.1 造模和分組 以普通飼料適應性喂養1周后，檢測血糖陰性，按隨機數字法將大鼠分為正常組8只和DN造模組24只。所有大鼠禁食12h后稱重，DN造模組按60mg/kg劑量在大鼠腹腔左側注射現配的1%STZ溶液。72h后經尾靜脈采血檢測各組大鼠空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）。DN大鼠造模依據文獻[10]，以FBG≥16.7mmol·L-1為造模成功標準。對于未達標準的大鼠，1周后按50mg/kg劑量再次行STZ腹腔注射，經尾靜脈采血復查血糖。本次DN造模組24只大鼠均一次造模成功。造模成功后將24只大鼠隨機分為模型組、中藥組和厄貝沙坦組，每組8只。

1.3.2 給藥方法 造模成功后，各組大鼠均繼續給予普通飼料喂養，其中中藥組和厄貝沙坦組以60kg體重成人用量的10倍換算大鼠給藥劑量[11]。換算結果如下：中藥組大鼠以益氣養陰活血方水煎液10mL/（kg·d）灌胃，相當于生藥劑量 50g/kg·d；厄貝沙坦組以厄貝沙坦混懸液10mL/（kg·d）灌胃，相當于25mg/（kg·d）劑量；正常組和模型組予等體積的蒸餾水灌胃。實驗期間各組大鼠按組分籠飼養，每天固定時間段進行灌胃操作，1次/d，共8周。期間所有大鼠均予普通飲食，自由飲水，未使用胰島素及其他降血糖藥物。實驗中每隔1周稱量大鼠BW并調整灌胃量。

1.3.3 標本采集 各組大鼠均于第8周末給藥后禁食，自由飲水，12h后稱量BW，以10%水合氯醛按0.3mL/100g劑量腹腔注射麻醉后，經腹主動脈收集血液標本，3 500r/min離心10min，分離血清用于檢測SCr和BUN水平。分離大鼠左側腎臟，于腎門處剪斷腎蒂，快速剝離腎臟包膜后以濾紙吸干并稱量腎臟質量（kidney weight，KW），計算腎臟指數（kidney index，KI）。稱重后將腎臟對切成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，加入戊二醇4℃固定4h以上，待行電鏡檢查。

1.4 指標檢測

1.4.1 一般情況觀察和KI計算 觀察各組大鼠毛色、體重、飲食、體態、靈敏度和精神狀況；第8周末稱量BW和左側腎臟KW，根據公式KI=KW（g）/BW（g）計算腎臟指數。

1.4.2 生化指標FBG、SCr、BUN檢測 實驗期間每2周末行尾靜脈采血，用羅氏血糖儀測FBG，血糖＜16.7mmol·L-1者及時剔除。此次實驗過程中所有DN造模組大鼠FBG檢測均＞16.7mmol·L-1，按照試劑盒說明書操作，在全自動生化分析儀上測定SCr和BUN水平。

1.4.3 腎臟足細胞形態和基底膜厚度電鏡觀察 收集以3.75%戊二醇固定4h以上的大鼠腎臟標本，以0.1mol·L-1的 PBS 漂洗 5～6 次，丙酮脫水、浸透，然后石蠟包埋、切片。將厚80～90nm的切片置于銅網上，醋酸鈾染液室溫染15～30min，雙蒸水洗凈后，再置于檸檬酸鋁染液中，室溫染10～20min，雙蒸水洗凈，濾紙吸干，透射電鏡下觀察[12]。

1.5 統計學分析 應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，所有數據先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，正態分布及滿足方差齊性的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；不符合條件數據進行非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況、BW和KI比較 正常組大鼠精神狀態良好，毛色光澤，進食正常，尿量正常，大便成麥粒狀，BW增加較快。模型組大鼠均精神萎靡，反應遲鈍，蜷臥拱背，毛發豎立無光澤、易脫落，伴有多飲、多食、多尿等癥狀，BW增長緩慢，大便較稀，次數多。中藥組和厄貝沙坦組有類似表現，但程度有所減輕。

造模前各組大鼠BW無統計學差異（P＞0.05）。給藥8周后，與正常組比較，模型組BW增長緩慢，KI明顯增高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組與厄貝沙坦組BW增長較快，差異均有統計學意義（P＜0.01）；KW 則無統計學差異（P＞0.05），KI低于模型組（P＜0.01），中藥組與厄貝沙坦組之間比較，KW、BW及KI均無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BW及KI比較（±s）Tab.1 Comparison of BW and KI in each group(±s)

表1 各組大鼠BW及KI比較（±s）Tab.1 Comparison of BW and KI in each group(±s)

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01Note:Compared with normal group,△△P＜0.01;compared with model group,**P＜0.01

組別 n K W（g） B W（g） K I正常組模型組中藥組厄貝沙坦組8 8 8 8 1.8 8±0.1 5 2.0 7±0.2 6 1.9 8±0.2 7 2.0 4±0.0 4 4 1 8.3 3±1 8.7 6 3 2 2.5 0±1 2.6 6△△3 4 2.3 9±1 4.2 6△△**3 6 7.5 5±1 4.5 1△△**0.0 0 4 5±0.0 0 0 1 0.0 0 6 4±0.0 0 0 8△△0.0 0 5 8±0.0 0 0 2△△**0.0 0 5 2±0.0 0 0 2△△**

2.2 各組大鼠FBG、SCr、BUN比較 給藥前及給藥8周后，與正常組比較，模型組、中藥組和厄貝沙坦組的FBG水平均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；而厄貝沙坦組和中藥組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組、中藥組和厄貝沙坦組大鼠 SCr、BUN 水平增高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組和厄貝沙坦組上述指標均明顯減低，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；中藥組和厄貝沙坦組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠腎臟組織超微結構比較 正常組大鼠毛細血管基底膜厚度均勻一致，均在正常范圍內，無電子致密物沉積，足細胞排列整齊，足突規則清楚，無廣泛融合。模型組基底膜明顯增厚，基底膜內可見電子致密物沉積，足細胞排列紊亂且足突融合，裂孔數目明顯減少，足細胞胞質線粒體明顯減少，線粒體嵴出現斷裂、脂滴沉積和空泡變性。與模型組比較，中藥組毛細血管基底膜增厚減輕，足細胞排列相對整齊，足突部分融合，足細胞損傷較小；厄貝沙坦組足突增寬，排列整齊，少數有融合，足細胞內線粒體損傷較模型組減輕。見圖1。

電鏡下測量各組基底膜厚度發現，與正常組比較，模型組和厄貝沙坦組基底膜增厚，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），而中藥組基底膜厚度則無統計學差異（P＞0.05）。與模型組比較，厄貝沙坦組與中藥組基底膜較薄（P＜0.01），中藥組基底膜薄于厄貝沙坦組（P＜0.05）。見圖 2。

表2 各組大鼠FBG、SCr及BUN比較（±s）Tab.2 Comparison of FBG,SCr and BUN in each group(±s)

表2 各組大鼠FBG、SCr及BUN比較（±s）Tab.2 Comparison of FBG,SCr and BUN in each group(±s)

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note:Compared with normal group,△△P＜0.01;compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01

組別n給藥前F B G（m m o l·L-1）給藥第8周F B G（m m o l·L-1）S C r（μ m o l·L-1）B U N（m m o l·L-1）正常組模型組中藥組厄貝沙坦組8 8 8 8 5.1 8±0.7 7 1 7.5 5±1.1 3△△1 7.7 9±1.1 3△△1 7.9 5±1.1 4△△5.0 3±1.0 8 2 7.5 8±1.8 6△△1 8.4 0±1.7 2△△**1 9.2 8±1.8 6△△**3 5.4 0±3.2 6 7 1.2 5±7.4 4△△4 8.1 6±6.3 1△△**5 2.7 8±6.2 4△△**3.6 5±0.5 6 1 3.0 6±2.7 9△△1 0.5 5±1.3 2△△**1 1.1 3±1.5 2△△*

3 討論

足細胞是腎小球濾過屏障的主要組成部分，完整的結構和足夠的數量是保證腎小球濾過膜正常運行的基礎。研究證明，足細胞結構異常、數量減少及相關分子表達變化致使腎小球濾過屏障通透性增加，從而導致蛋白尿的產生，進一步引起腎小球硬化、腎功能進行性喪失等病變，與DN的發生與發展密切相關[13]。張秀麗等[14]研究發現，足細胞病變與糖尿病大鼠血流動力學的改變有關。細胞因子損傷、氧化應激、代謝紊亂等是足細胞病變的影響因素。熊何健等[15]研究顯示，高糖可通過活性氧自由基啟動足細胞凋亡，誘導其從基底膜上脫落，進而引起蛋白質漏出，導致蛋白尿。

圖1 各組大鼠腎臟足細胞超微結構比較（20 000×）Fig.1 Comparison of podocyte ultrastructure in each group(20 000×)

圖2 各組大鼠腎小球基底膜厚度比較Fig.2 Comparison of basement membrane thickness in each group

目前DN尚缺乏特效的治療方法，中醫認為DN是在消渴的基礎上發展而來，屬于本虛標實之證，以脾腎氣陰兩虛為本，以血瘀阻滯為標，病變部位在絡脈，以補氣益腎、化瘀通絡為治則。研究證實，益氣養陰活血方對DN大鼠24h尿蛋白定量、血脂、SCr、尿β2微球蛋白水平等均有改善作用[6]。李中南等[16]研究發現，具有益氣養陰活血作用的丹蛭降糖膠囊能夠明顯減輕DN大鼠的足細胞損傷。本研究通過觀察益氣養陰活血方對DN大鼠血糖、腎功能以及腎臟足細胞的影響，研究中藥治療DN的方法。結果顯示，益氣養陰活血方能夠有效降低DN大鼠FBG，改善腎功能。筆者推斷益氣養陰活血方可能通過減輕足細胞損傷，從而延緩腎臟病變過程，提示本方對DN早期腎臟病變有改善作用。本研究中模型組大鼠腎小球毛細血管基底膜明顯增厚，伴有電子致密物沉積，足細胞損傷主要表現為數量減少、形態異常、足突紊亂融合，導致濾過膜完整性受損；而足細胞內線粒體減少，可見脂質沉積，提示DN狀態下足細胞結構異常，與文獻報道一致。中藥組足細胞損傷減輕，提示益氣養陰活血方能夠保護足細胞，且改善程度優于厄貝沙坦組。

進一步分析益氣養陰活血方作用機制，方中黃芪、山萸肉為君藥，益氣固本、滋補肝腎；臣藥茯苓、白術益氣健脾，協助黃芪益氣；葛根、麥冬生津養陰；五味子、女貞子、旱蓮草協助山萸肉滋補肝腎、固腎澀精；佐使藥紅花、桃仁、川芎活血化瘀，補而不留邪，祛邪而不傷正；知母、玄參寓泄于補，以泄助補，使藥性平和。全方標本兼治，共奏益氣養陰之效。李志杰等[17]研究表明，黃芪單體可提高早期DN大鼠足細胞的nephrin和podocin蛋白表達水平，從而延緩DN的病理進展。紅花黃色素具有減低早期DN患者血清炎癥因子表達，抑制細胞凋亡，減少腎臟氧化應激等作用[18-19]。山萸肉預防腎臟病變的機制主要是改善氧化應激，抑制AGEs形成[20]。還有研究證實，血管內皮生長因子可損傷腎小管內皮細胞和系膜區[21]，張伊娜等[22]研究發現，益氣養陰活血方可抑制血管內皮生長因子的表達，故降低血管內皮生長因子表達，可能也是該方保護足細胞的機制之一。

綜上所述，本研究進一步證明益氣養陰活血方可以通過減輕足細胞損傷起到保護腎臟功能的作用，從而治療DN，且作用與厄貝沙坦無顯著差異，為該方進一步臨床應用提供了實驗依據。筆者推斷益氣養陰活血方可能通過降低炎癥因子水平、抗氧化、影響足細胞蛋白表達、降低血管內皮生長因子表達等多途徑保護腎小球足細胞，其是否影響足細胞相關的其他蛋白表達尚有待進一步研究。