天名精根提取物調控TLRs信號抑制RAW264.7細胞炎癥的研究

浙江中醫藥大學生命科學學院 杭州 310053

菊科植物天名精（Carpesium abrotanoides Linn.），在《神農本草經》中被列為上品，其性味甘、寒，主瘀血、血瘕欲死[1]，臨床上廣泛用于帶狀皰疹、流行性腮腺炎、口腔糜爛、毒蛇咬傷等癥的治療[2]。研究發現，其全草的乙醇提取物對LPS誘導的體外炎癥反應有一定緩解作用，但具體機制尚不清楚[3]。

炎癥是許多疾病的主要危險因素，而巨噬細胞是組成機體抵御外來病原微生物（如細菌、病毒和真菌等）入侵的第一道防線的重要免疫細胞[4-5]。巨噬細胞通常通過識別、吞噬和殺死微生物，在宿主免疫系統中發揮關鍵作用。炎癥期間，巨噬細胞產生大量的炎癥介質，如誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）以及白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎細胞因子[6]，這些炎癥介質和細胞因子的過量產生可能會對機體器官產生不利影響。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌外膜中最常見的致病性內毒素成分，在LPS刺激下小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7會發生快速炎癥反應，釋放大量促炎細胞因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-6，以及炎癥介質前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）、COX-2和iNOS[6]；而金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的革蘭陽性病原菌，可引起嚴重感染，是多種感染性疾病發病和致死的主要原因[7]。

本實驗通過提取天名精根的有效成分，以RAW264.7巨噬細胞為研究對象，采用LPS和滅活的金黃色葡萄球菌刺激RAW264.7細胞，構建體外巨噬細胞炎癥模型，研究天名精根提取物對巨噬細胞體外炎癥的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞和菌種 RAW264.7細胞株、金黃色葡萄球菌ATCC 25923和ATCC 43300均購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑 DMEM高糖培養液購于杭州吉諾生物醫藥技術有限公司（批號：2017022705）；胎牛血清購于杭州四季青生物制品公司（批號：150208）；LPS（011：B4）購自 Sigma公司（批號：L2630）；核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）p65鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司（批號：B0612）；逆轉錄試劑盒、羊抗鼠IgG購自北京康為世紀生物有限公司（批號：30147、10146）。

1.3 主要儀器 SpectraMax190酶標儀購于美國Molecular Devices公司；3111 CO2培養箱購于美國Thermo Fisher Scientific 公 司 ；PowerPacTMHCBIORAD電泳儀購于美國Bio-Rad公司；5427R低溫高速離心機購于德國 Eppendorf公司；Stepone plus熒光定量PCR儀購于美國ABI公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機購于寧波新芝科器研究所；DMI8熒光顯微鏡購于德國Leica公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 天名精根提取物制備 天名精采集于杭州市富陽區場口鎮上村附近山域，經浙江中醫藥大學中藥學教研室鑒定為菊科天名精屬天名精的全草。人工采摘地上部分高50cm及以上的植株，將完整植株置于陽光下直曬，1～2d后裝入筐中，放通風處1～2d，待水分向表層滲出后，復曬l～2d直至全干。曬干后，待全草自然降溫至常溫，剪取根部，放入粉碎機中粉碎，過60目篩。收集粉末，置于滅菌烘干的500mL玻璃瓶中密封，4℃保存備用。精密稱取5.0g天名精根粉末，加80%乙醇超聲提取60min，重復3次，合并濾液，旋蒸揮干后冷凍干燥得0.553g天名精根乙醇提取物（ethanol extract of Carpesium abrotanoides Linn.’s root，ECA），得率為 10.67%；1.5g ECA 加入石油醚超聲提取40min，重復3次，合并濾液，旋蒸揮干，冷凍干燥后得到0.16g天名精根石油醚提取物（petroleum ether extract of Carpesium abrotanoides Linn.’s root，PCA），得率10.6%。每100.00μg ECA相當于937.21μg天名精根粉末；每100.00μg PCA相當于8.84mg天名精根粉末。

1.4.2 熱滅活的金黃色葡萄球菌（heat-inactivated preparations of Staphylococcus aureus pathogens，SAC）制備 金黃色葡萄球菌菌株在LB培養基中，37℃條件下培養。待達到對數生長期（600nm處的OD值為0.5，即為 5×107個/mL），調整數量后 80℃熱滅活 1h，以培養基洗滌2次，最終將數量調整為1×108個/mL，-20℃保存。

1.4.3 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 檢測 色譜條件：C18柱(Φ4.6mm×250mm，5μm)；流動相乙腈由 5%梯度洗脫至100%；測定時間30min；檢測波長210nm，流速1mL·min-1，柱溫 30℃，進樣體積 10μL。

1.4.4 細胞培養 RAW264.7細胞采用含有10%胎牛血清、青霉素100U·mL-1及鏈霉素100U·mL-1的DMEM高糖培養液培養，置于37℃、5%CO2培養箱中，每3d傳代1次。

1.4.5 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數生長期的細胞，倒置顯微鏡下觀察計數，調整細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板，每孔200μL，置于培養箱貼壁培養 24h，分別用 0、10、25、50、100、200μg·mL-1ECA或PCA處理細胞，每組設6個復孔，每孔終體積為 200μL。作用 6h 后每孔加入 5g·L-1MTT 20μL，暗室孵育4h，棄去培養液，然后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μL，以空白孔調零，震蕩混勻后，酶聯免疫監測儀上490nm波長測定各孔吸光度值。

1.4.6 qPCR檢測Toll樣受體-2（Toll-like receptor-2,TLR-2）、TLR-4、髓樣分化因子 88（myeloid differentiation primary response 88,MyD88）、IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA表達 取對數生長期細胞，調整細胞密度為1×105個/mL，接種于12孔板，每孔1mL，置于培養箱貼壁培養24h，分為正常對照組（不加干預的RAW264.7細胞），炎癥模型組（2μg·mL-1LPS孵育RAW264.7細胞6h或MOI=5的SAC孵育RAW264.7 細胞 3h），ECA 組 （100μg·mL-1ECA 與LPS共同孵育6h或與SAC共同孵育3h），PCA組（100μg·mL-1PCA與LPS共同孵育6h或與SAC共同孵育3h）。細胞處理結束后，收集細胞，以Trizol法提取各組細胞中的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA的純度及濃度。根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA第一鏈，采用熒光定量PCR進行擴增，每樣本設3個復孔。所有引物由上海生工生物技術有限公司合成，序列如表1所示。擴增條件：95℃預變性 5min，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 5s，擴增 40 個循環。mRNA相對表達量計算采用Ratio=2-ΔΔCT方法，ΔCT1=對照組目的基因CT值-對照組內參基因CT值，ΔCT2=實驗組目的基因CT值-實驗組內參基因CT 值，ΔΔCT=ΔCT2－ΔCT1，代入公式 2-ΔΔCT計算，即得到mRNA相對表達量。

1.4.7 Western blot檢測NF-κB p65蛋白的表達取對數生長期的細胞，倒置顯微鏡下觀察計數，調整細胞密度為2×105個/mL，接種于6孔板，每孔2mL，置于培養箱貼壁培養24h，細胞分組同1.4.6中。處理結束后，收集各組細胞，以預冷的PBS洗滌5次，加入預冷的細胞裂解液裂解細胞，混勻后超聲破碎細胞；4℃、12 000r/min離心30min，轉移上清液于新的EP管中，以BCA法測定蛋白濃度。一定量的蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合后煮沸5min，SDS-PAGE電泳3h，200mA恒流轉膜2h，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST漂洗3次后分別加入相應一抗，4℃孵育過夜。次日TBST漂洗3次，加入二抗37℃孵育2h，TBST漂洗3次后進行ECL顯色。用凝膠成像分析系統分析電泳條帶，以內參為對照，計算各處理組目的蛋白的表達情況。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 統計學分析 采用GraphPad Prism 6.0統計軟件進行統計學分析。計量數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，大于兩組比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HPLC分析 ECA的HPLC檢測結果見圖1。PCA的HPLC檢測結果見圖2，其中以峰A的物質為主，于28.78min出峰，峰高1 928mAU。

2.2 各組細胞增殖情況比較 MTT結果顯示，與正常對照組比較，當ECA或PCA濃度≥200μg·mL-1時，細胞存活率降低（P＜0.01），提示高濃度的ECA或PCA對細胞增殖具有明顯抑制作用。見圖3。故采用100μg·mL-1ECA和100μg·mL-1PCA進行后續研究。

2.3 天名精根提取物對細胞炎癥因子mRNA表達的影響 與正常對照組比較，2μg·mL-1的LPS刺激6h后，RAW264.7 細胞中的炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達增加（P＜0.01），而 100μg·mL-1的 ECA或PCA干預后，這些炎癥因子mRNA的表達均顯著下降（P＜0.01）。與正常對照組比較，以MOI=5的SAC刺激細胞 3h 后，RAW264.7 細胞中 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達增加（P＜0.01），而 100μg·mL-1的ECA或PCA干預后，相關炎癥因子mRNA的表達顯著下降（P＜0.01）。見圖 4。

2.4 天名精根提取物對NF-κB表達的影響 與正常對照組比較，無論是LPS刺激6h還是以MOI=5的SAC刺激RAW264.7細胞3h后，細胞中的NF-κB mRNA和NF-κB p65蛋白表達量均明顯增加（P＜0.01），在 100μg·mL-1ECA 或 PCA 干預后，NF-κB mRNA和NF-κB p65蛋白表達量低于LPS組和SAC組（P＜0.01）。見圖 5。

圖1 ECA的HPLC檢測結果Fig.1 ECA HPLC test results of ECA

圖2 PCA的HPLC檢測結果Fig.2 HPLC test results of PCA

圖3 不同濃度天名精根提取物對細胞增殖的影響Fig.3 Effect of different concentration extracts of Carpesium abrotanoides Linn.’s root on cell proliferation

2.5 天名精根提取物對TLRs/MyD88 mRNA表達的影響 LPS刺激6h后，與正常對照組比較，RAW264.7細胞TLR-2的mRNA表達無統計學差異（P＞0.05），TLR-4及 MyD88 mRNA 表達均增加（P＜0.01，P＜0.05）。ECA或 PCA 干預后 TLR-2的 mRNA表達與LPS組比較無統計學差異（P＞0.05）；TLR-4 mRNA表達量明顯低于LPS組，差異有統計學意義（P＜0.01）；PCA干預后MyD88 mRNA表達量明顯低于LPS組，差異有統計學意義（P＜0.05），而ECA干預后MyD88 mRNA表達與LPS組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 不同天名精根提取物對炎癥因子mRNA表達的影響Fig.4 Effects of ECA or PCA on mRNA expression of inflammatory factors

SAC刺激3h后，與正常對照組比較，TLR-2及MyD88 mRNA表達增加（P＜0.01），TLR-4 mRNA表達無統計學差異（P＞0.05）。ECA或PCA干預后，TLR-2 mRNA的含量明顯低于SAC組（P＜0.01），MyD88 mRNA 表達低于 SAC 組（P＜0.05，P＜0.01），而TLR-4 mRNA表達無統計學差異（P＞0.05）。見圖6。

3 討論

天名精又名鹿活草，是一種兩年生草本植物，常應用于傳統中醫治療中，其主要藥效成分為倍半萜內酯[8]?，F有實驗表明，天名精提取物具有抗菌、抗炎等功效[9-11]。既往實驗通常分離其地上部分、花或果實，提取活性成分進行研究[9-11]，在本研究中筆者根據傳統醫方提示，以天名精根作為研究對象，從天名精根中分離有效成份，希望發現并確定其功能化合物。經過HPLC檢測，與汪蕾等[12]、沈冰冰等[13]以及楊勇勛等[14]的研究進行比對發現，ECA和PCA的檢測圖譜與目前已知的天名精化合物群無法重合。對PCA中主要的A峰物質進行質譜檢測，發現其分子量為360.2，與已知的天名精所提取物無一相同，故筆者推測ECA和PCA所含主要成分可能是一類新的萜類物質。

圖5 不同天名精根提取物對NF-κB表達的影響Fig.5 Effects of ECA or PCA on the expression of NF-κB

TLR是近年來發現的細胞表面受體家族，是連接天然免疫和適應性免疫的橋梁。TLR-2作為革蘭陽性菌的主要識別受體，在抗菌免疫中發揮顯著作用。TLR-2在人單核細胞、巨噬細胞表面都呈較高水平的表達[15]，一般和TLR-1或TLR-6形成二聚體，能夠識別革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的脂蛋白、革蘭陽性菌的脂磷壁酸、分支桿菌的阿拉伯糖甘露糖脂，TLR-2和TLR-1二聚體還可以識別革蘭陰性菌的三?；鞍?，TLR-2和TLR-6二聚體可以識別革蘭陽性菌的二?；鞍祝哂休^廣泛的識別普遍性[15]。而TLR-4是一種革蘭陰性菌的主要識別受體，其可以激活下游蛋白質復合體相互作用，釋放促炎細胞因子或Ⅰ型干擾素（interferon type Ⅰ，IFN-Ⅰ）[16]。

本研究在體外模擬了急性炎癥常見的革蘭陰性和革蘭陽性病原菌刺激巨噬細胞的炎癥模型，研究結果表明，天名精根提取物降低LPS誘發的巨噬細胞中 TLR-4介導的 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達。同時還可以緩解由SAC引起的巨噬細胞炎癥反應。在研究中發現ECA和PCA可以抑制由SAC刺激TLR-2介導的 IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA 表達。目前研究表明無論TLR-2還是TLR-4主要通過MyD88依賴和β-干擾素TIR結構域銜接蛋白（TIR-domaincontaining adaptor inducing interferon-β，TRIF）依賴的兩個下游分支途徑調節炎癥基因的表達，而MyD88是參與TLRs介導的炎癥表達的關鍵信號適配基因，其可以募集IL-1受體相關激酶1（IL-1 receptor associated kinase1，IRAK1）和 IRAK4 至 TLRs[17]，這個信號復合體也可以促進這些激酶的磷酸化，磷酸化的IRAK1可以激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumour necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6），此外可以激活I-κB激酶（I-kappaB kinase，IKK）復合體，導致轉錄因子 NF-κB 的活化[18]。NF-κB是在TLRs介導的炎癥中起核心作用的基因，已有研究在IFN-γ、IL-10、TNF-α 和 IL-6等大多數細胞因子基因的啟動子中發現了NF-κB編碼結合位點[19-21]。在無刺激的條件下，NF-κB通常與I-κB固定于細胞質中，而當外源病原菌刺激時，I-κB磷酸化導致NF-κB p65和p50亞基釋放，易位于核并與相關的DNA序列結合，誘導靶基因表達[22]。本研究結論也支持了這一觀點，無論是LPS激活TLR-4還是SAC激活TLR-2都會使MyD88的表達增加，促進NF-κB活化，ECA和PCA均可以抑制這一通路的激活，從而緩解炎癥癥狀。本研究也證實了，天名精根提取物對革蘭陰性和陽性菌引起的巨噬細胞體外炎癥均有良好的緩解作用。

圖6 不同天名精根提取物對TLRs/MyD88 mRNA表達的影響Fig.6 Effects of ECA or PCA on mRNA expression of TLRs/MyD88

綜上所述，天名精根提取物可以抑制由LPS和SAC刺激RAW264.7細胞引起的體外炎癥反應，其機制可能與抑制TLRs信號通路有關。本實驗根據傳統醫方首次對天名精根進行了活性成分提取，得到一類新型的萜類物質，并進行藥理活性研究，為天名精的開發提供了新的實驗基礎，但所得提取物的結構式尚待進一步分析與實驗。