兒茶素沒食子酸酯對人視網膜色素上皮細胞氧化應激損傷的機制研究

劉艷 ，張懿 ，雷銳 ，周海艷

年齡相關性黃斑變性 （Age-related macular degeneration，AMD）為老年人群視力減弱的主要病因之一。早期研究已證實視網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化應激損傷與AMD的發生、發展關系密切[1-3]。當前在AMD治療研究大多集中在抗氧化劑的藥理活性上面，主要是對各種中成藥的探討，但對它們的作用效果及作用機制報道較少，于是尋找一種預防和治療AMD的有效藥物勢在必行。兒茶素沒食子酸（Epigallocatechin gallate，EGCG）是一種天然黃烷醇型活性化合物，具有抗氧化應激及抗炎性反應的藥理活性[4-6]，而且研究發現其對人晶狀體上皮細胞氧化應激損傷具有較好的藥理活性[7]。腫瘤壞死因子相關受體因子6（TRAF6）屬于胞內銜接蛋白，可以傳導胞膜受體介導的胞外刺激信號，誘導下游TAK1介導的信號通路激活，導致氧化應激損傷的發生[8-9]。因此，本課題主要研究EGCG對人視網膜色素上皮 （ARPE-19）細胞氧化應激損傷的影響，并探討其對介導氧化應激TRAF6/TAK1信號通路活化的影響，以期對AMD的治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人視網膜色素上皮 （ARPE-19）細胞來源ARPE-19細胞購自武漢巴菲爾生物有限公司（來源于美國ATCC細胞庫）。兒茶素沒食子酸酯（成都普瑞法科技開發有限公司，批號：1257-08-5，純度≥98%）；DMEM 培養基（美國 ScienCell公司）；胎牛血清 （美國Gibco公司）；胰蛋白酶購自美國Thermo scientific 公司（批號：R001100）；MDA、NO、SOD1 試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司 （批號：TS-49350、TB-58260、BR-46250）；CCK8 試劑盒購自上海恒遠公司（批號：ST-20059）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司 （批號：P0012AC）；兔抗大鼠 β-actin（貨號 ab108267）、HO-1（貨號 ab256745）、SOD1 （貨號 ab203214）、TRAF6（貨號 ab552260）、TAK1（貨號 ab205628）及 p-TAK1（貨號ab587415）一抗均購自英國Abcam公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗購自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器

儀器BIORAD-550型酶標儀（美國伯樂公司）；BBS-V800型單人超凈臺 （山東鑫貝西公司）；SPX-250型細胞培養箱 （美國Thermo公司）；GE-100型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；雙色紅外激光成像系統（BIO-RAD，美國）；7230G數顯可見紫外分光光度計測定儀（上海菁華）。

1.3 ARPE-19細胞培養

采用常規DMEM完全培養基 （10%的胎牛血清、1%的100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）培養，培養箱條件為37℃、5%CO2濃度，待細胞長滿至90%左右時用PBS清洗后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察待細胞變圓后加入培養基終止消化，分裝于3個培養瓶進行傳代培養。

1.4 分組及藥物處理

將細胞分為正常對照組、H2O2（100 μmol/L）誘導組、H2O2+低劑量（40 μmol/L）EGCG 組、H2O2+中劑量（80 μmol/L）EGCG 組、H2O2+高劑量（160 μmol/L）EGCG組，采用H2O2刺激細胞構建氧化應激損傷模型，同時加入EGCG干預細胞進行藥物治療，二者同時作用長達24 h后進行后續實驗。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 CCK8法 將對數生長期細胞進行消化重懸接種于96孔板，待細胞貼壁后吸去舊培養基，按“1.4”項分組及藥物處理24 h后吸去舊培養基，然后每孔加入10 μL CCK8試劑，繼續放置培養箱中孵育1 h后，置于酶標儀中測定每孔細胞的吸光度OD值，檢測波長設置為450 nm，并計算細胞存活率。細胞生存率（%）=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.5.2 MDA、NO含量及SOD活性檢測 取對數生長期的ARPE-19細胞，清洗、消化、重懸細胞后，取適量濃度細胞接種至6孔板中，每組實驗設置6個復孔，37℃、5%CO2的培養箱中培養過夜。低、中、高劑量EGCG和H2O2共孵育細胞，加入含藥物的終體積為2 mL/孔。藥物作用24 h后，收集細胞裂解成勻漿液，按照試劑說明書測定MDA、NO含量及SOD活性。

1.5.3 Western Blot將“1.5.2”項收集的細胞裂解制備成勻漿，離心收集上清提取細胞蛋白。BCA法測定細胞總蛋白濃度。各孔取50 μg的蛋白上樣，于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離 （濃縮膠70 mV電壓，40 min；分離膠120 mV電壓，90 min）。將分離后的蛋白電轉移 （275 mA電流，90 min）至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1h。用TBST洗膜3次，每次8 min，分別加入HO-1、SOD1、TRAF6、TAK1 及 p-TAK1 抗體（體積稀釋比例均為1:1000）4℃反應過夜。次日先以TBST洗膜3次，每次10 min。后加入HRP標記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1:3000），室溫反應1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min。按ECL試劑盒說明進行顯影。采用雙色紅外激光成像系統對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗，若P＜0.05，則認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EGCG對ARPE-19細胞增殖的影響

與正常對照組比較，H2O2誘導組中細胞增殖受到明顯抑制（P＜0.05）；與 H2O2誘導組比較，各劑量 EGCG組細胞相對存活率明顯升高，差異均有顯著性（P＜0.05），并且隨著EGCG劑量的增加，細胞相對存活率也隨著增高，呈現出濃度依賴性（F=10.326，P＜0.05）（圖 1）。

圖1 不同組間ARPE-19細胞增殖情況比較。1正常對照組；2 H2O2誘導組；3 H2O2+低劑量EGCG組；4 H2O2+中劑量EGCG組；5 H2O2+高劑量EGCG組。*與正常對照組比較，P＜0.05；#與H2O2誘導組比較，P＜0.05。

2.2 EGCG對ARPE-19細胞勻漿氧化應激產物水平的影響

與正常對照組比較，H2O2誘導組中細胞勻漿MDA及NO水平明顯升高，SOD1活性顯著降低（P＜0.05）；與H2O2誘導組比較，各劑量EGCG組細胞勻漿MDA及NO水平明顯降低，而SOD1活性明顯升高，差異均有顯著性（P＜0.05），并且隨著EGCG劑量的增加，細胞勻漿MDA及NO水平隨著降低、SOD1活性隨之升高，表現出濃度依賴性 （F值分別為6.357、14.361、10.326，P 值均＜0.05）（表 1）。

表1 EGCG對ARPE-19細胞氧化應激產物水平的影響（xˉ±s）

2.3 EGCG對ARPE-19細胞中HO-1及SOD1表達的影響

與正常對照組比較，H2O2誘導組中HO-1及SOD1表達水平明顯降低（P＜0.05）；與 H2O2誘導組比較，各劑量EGCG組細胞HO-1及SOD1表達水平明顯升高，差異均有顯著性（P＜0.05），并且隨著EGCG劑量的增加，細胞HO-1及SOD1表達水平而隨著升高，表現出濃度依賴性 （F值分別為11.035、8.361，P 值均＜0.05）（圖 2）。

圖2 不同組間HO-1及SOD1蛋白表達比較。1正常對照組；2 H2O2誘導組；3 H2O2+低劑量EGCG組；4 H2O2+中劑量EGCG組；5 H2O2+高劑量EGCG組。2A HO-1蛋白表達；2B SOD1蛋白表達。*與正常對照組比較，P＜0.05；# 與 H2O2誘導組比較，P＜0.05。

2.4 EGCG對ARPE-19細胞中TRAF6/TAK1信號通路的影響

與正常對照組比較，誘導組中TRAF6表達及TAK1磷酸化水平明顯升高（P＜0.05）；與 H2O2誘導組比較，各劑量EGCG組細胞TRAF6表達及TAK1磷酸化水平明顯降低，差異均有顯著性（P＜0.05），并且隨著EGCG劑量的增加，細胞TRAF6表達及TAK1磷酸化水平而隨著降低，表現出濃度依賴性（F值分別為 5.395、7.039，10.326，P 值均＜0.05）（圖 3）。

圖3 不同組間TRAF6及p-TAK1蛋白表達比較。1正常對照組；2 H2O2誘導組；3 H2O2+低劑量EGCG組；4 H2O2+中劑量 EGCG組；5 H2O2+高劑量EGCG組。3A TRAF6蛋白表達；3B p-TAK1蛋白表達。* 與正常對照組比較，P＜0.05；# 與H2O2誘導組比較，P＜0.05。

3 討論

AMD的病原學及發病機制尚未闡明，當前研究證實細胞老化、氧化應激損傷、炎性免疫、血管生成和抑制因子上調等因素均會誘發AMD的發生[10]。伴隨著年齡的增長，機體抗氧化能力也隨之減弱，視網膜色素上皮細胞介于脈絡膜毛細血管層及光感受器細胞層之間，容易引起機體氧自由基的攻擊，進一步引發AMD等視網膜病變的發生。研究發現AMD發病早期便會出現視網膜色素上皮細胞的氧化應激損傷，并常伴隨該細胞凋亡的出現[11]。

視網膜色素上皮細胞發生氧化損傷的細胞器為線粒體，而損傷的嚴重程度由活性氧的水平決定，后者可介導該細胞凋亡的發生，進一步參與視網膜色素細胞屏障功能的損傷。體外研究發現，氧化應激損傷能夠導致視網膜色素上皮細胞發生凋亡，這可能為AMD早期該細胞發生凋亡的其中一個原因[12]。H2O2屬于一種極易透過細胞膜的強氧化劑，通過增加細胞內活性氧水平導致細胞氧化損傷的作用[13]。

EGCG作為綠茶的主要活性成分之一有著顯著的抗腫瘤功效，能通過介導腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞分裂周期、調節相關信號通路活性、降低癌細胞侵襲及轉移等來起到抑制腫瘤的作用[14]；除此之外，EGCG已被證實在抗氧化應激等方面也起著較好的藥理作用[15]。然而EGCG對視網膜色素上皮細胞的保護作用研究未見報道，于是本研究采用活性氧形式之一的H2O2作用ARPE-19細胞，引起該細胞的氧化應激損傷，探討EGCG對ARPE-19細胞的保護作用。

本實驗研究發現，本文采用H2O2體外誘導ARPE-19細胞氧化損傷模型，發現H2O2誘導組細胞相對存活率明顯降低，細胞勻漿中氧化應激產物MDA、NO水平升高、而SOD1酶活性降低，細胞中HO-1、SOD1蛋白表達顯著降低，說明實驗中構建的ARPE-19氧化損傷細胞模型成功。接著采用低、中、高劑量EGCG干預細胞后發現，EGCG可明顯抑制ARPE-19細胞勻漿中氧化應激產物MDA、NO水平，而能誘導SOD1酶活性及水平的上升，進而誘導ARPE-19細胞增殖能力的升高。提示EGCG對H2O2誘導的人視網膜色素上皮細胞的氧化損傷具有保護作用。

胞內銜接蛋白TRAF6活化后可在TAB-1及TAB-2介導下，與MAP3K家族成員TAK1結合并將其激活，后者可進一步激活氧化應激信號通路[16]。研究已提出TRAF6/TAK1信號通路可參與氧化應激損傷，進而抑制了抗氧化酶HO-1、SOD1表達，誘導了氧化應激產物MDA、NO的產生[17]。研究還發現EGCG可通過抑制TRAF6信號傳導進而降低黑色素瘤細胞的增殖[18]。本實驗發現采用低、中、高劑量EGCG干預ARPE-19細胞后，TRAF6表達及p-TAK1水平明顯降低，說明EGCG能抑制氧化損傷的ARPE-19細胞中TRAF6/TAK1信號通路的活化，從而降低氧化應激損傷。綜上所述，研究結果表明H2O2可以成功的誘導ARPE-19細胞氧化損傷模型，EGCG干預后能明顯降低氧化應激產物的產生，提示EGCG對AMD具有保護作用，這種保護作用可能與抑制TRAF6/TAK1信號通路活化有關。