抑制巨噬細胞Act 1表達對黑色素瘤肺轉移的影響

王 佳，李 麗，黎冰林，盧 鑫，王麗京，楊永霞

(1.廣東藥科大學 生命科學與生物制藥學院，廣州 510006； 2.廣東藥科大學 醫藥信息工程學院， 510006)

黑色素瘤是高度惡性的腫瘤，在腫瘤發生的早期就會發生遠端轉移[1]。在我國，雖然黑色素瘤的發生率較低，但其遠處轉移預后很差，5年生存率低于5%[2]。侵襲與轉移是惡性腫瘤最顯著的生物學特征，在腫瘤的治療過程中，阻止腫瘤細胞的侵襲與轉移尤為重要，這也是治療腫瘤成敗的關鍵因素。小鼠黑色素瘤細胞B16-F10具有高轉移特性，已被廣泛地用于研究腫瘤發生、轉移過程的相關參數，是研究腫瘤侵襲轉移的理想模型[3]。

越來越多的研究表明，機體體內微環境的改變與腫瘤的發生與發展密切相關[4-5]。TAM (腫瘤相關巨噬細胞)被認為是腫瘤發生、發展和侵襲、轉移最為重要的細胞之一[6]。近幾年來的研究發現，TAM可以分泌多種炎癥因子、生長刺激因子、蛋白水解酶和一些細胞因子[7]，這些因子既能降解腫瘤細胞外基質，還能促進腫瘤中血管的形成[8]。TAM可構成實體瘤細胞群體的50% ～ 80%，TAM浸潤與乳腺癌、結直腸癌、肝癌、宮頸癌和肺癌的不良預后密切相關[9]。NF-κB活化因子1(NF-κB activator 1，Act 1)在機體免疫反應的作用極為廣泛，是NF-κB和C/EBP介導的炎癥反應下游信號通路的重要分子[10]。而NF-κB 在炎癥、先天免疫和癌癥中起著至關重要的作用[11]，且NF-κB信號通路能促進癌細胞的生長和生存[12]。已有文獻表明NF-κB信號通路與腫瘤相關，且都強調了這種轉錄因子在癌癥研究中的重要性[13]。Act 1主要介導IL-17信號通路的活化并參與炎癥反應。Welte等研究發現，IL-17能夠促進乳腺癌的發生與發展[14]。此外已有研究發現，通過IL-17B/IL-17BR信號傳導，能夠促進人的骨髓干細胞與乳腺癌腫瘤細胞的轉移[15]。Act 1的缺少會抑制IL-17誘導的NF-κB通路被激活[16]。且通過小鼠過敏性哮喘模型發現，上皮細胞中Act 1的缺失能減輕IL-25引起的Th2型免疫反應和肺部炎癥[17]。

鑒于NF-κB信號能夠促進癌細胞的生長，且巨噬細胞與腫瘤的發生與發展密切相關。目前，Act 1在腫瘤中的作用研究很少。因此，本研究以巨噬細胞Act 1表達被靶向抑制的小鼠(anti-Act 1)為研究對象，采用尾靜脈注射B16-F10細胞，誘導小鼠肺轉移模型，探討巨噬細胞Act 1在腫瘤轉移過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

Anti-Act 1小鼠構建于C57BL/6背景，由中國科學院上海細胞生物學研究所構建并贈送[18]。6～8周齡雄性C57BL/6小鼠24只(體重18～22 g)從廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0002]購買，飼養于廣東藥科大學SPF級動物中心[SYXK(粵)2017-0125]。所有的動物實驗都是按照中國動物實驗指南及其他相關國際準則進行的實驗[動物福利倫理審批號：gdpulac2017026]。小鼠惡性黑色素瘤B16-F10細胞系(B16,ATCC,CCL-247)從密歇根大學耿建國實驗室獲得。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物anti-Act 1小鼠的鑒定

剪取anti-Act 1小鼠的尾部，提取DNA，PCR擴增目的片段基因，PCR引物1:5′-CTG GTG CAG ACA GCC TAG CTG-3′，引物2： 5′-CCT GCG AGC TAAAGT CCT GGA-3′ (Invitrogen)，基因擴增產物條帶為250 bp。對基因鑒定為陽性的小鼠，提取腹腔巨噬細胞，采用Western blot法檢測巨噬細胞上Act 1的表達情況。化學發光顯影儀避光顯影和拍攝。實驗所用抗體為Act 1 (Santa Cruz)、β-actin(Bioworld)。

1.2.2 細胞培養

小鼠惡性黑色素瘤B16-F10細胞系(B16,ATCC,CCL-247)在DMEM培養基(10%胎牛血清、200 mg/mL鏈霉素和200 U/mL青霉素)，溫度37℃，5% CO2/95%的培養箱中維持生長。

1.2.3 體內肺轉移模型的建立

C57BL/6和anti-Act 1雄性小鼠各12只，分別設為對照組和實驗組，參照Qi等[19]的方法建立體內肺轉移模型。將B16-F10細胞(1×105/0.2 mL)通過尾靜脈的注射方法，分別注射到C57BL/6和anti-Act 1的體內。20 d后腹腔注射氯胺酮10 mg/kg、阿托品1 mg/kg、鹽酸西拉嗪20 mg/kg麻醉，頸部脫臼處死小鼠。

1.2.4 肺組織病理組織學觀察

處死C57BL/6和anti-Act 1小鼠后，取肺組織，平鋪在濾紙上，觀察肺組織轉移的結節數。再將其置于4%的多聚甲醛液中固定過夜，脫水后石蠟包埋，切片，HE染色。顯微鏡下觀察肺組織腫瘤轉移的情況。

1.2.5 免疫組化法檢測肺組織Ki67、CD45、CD68的表達

采用常規石蠟切片(3 μm)，通過Ki67(Abcam)、CD45 (Proteintech) 和CD68 (Proteintech) 對肺、肺轉移灶部位進行特異性染色，顯微鏡下觀察腫瘤細胞的增殖情況和炎癥浸潤程度。石蠟切片脫蠟后，高溫高壓抗原修復8 min，3% H2O2-甲醇溶液中孵育30 min，10% BSA阻滯1 h，切片用兔抗鼠Ki67(Abcam)、CD45 (Proteintech) 和CD68 (Proteintech) 進行抗體孵育，4℃過夜，孵育二抗(兔抗，中杉金橋)，DAB染色，蘇木素復染。光學顯微鏡拍攝并記錄分析。并運用免疫熒光法檢測肺組織轉移灶上巨噬細胞Act 1的表達情況，熒光顯微鏡避光拍攝。實驗所用抗體為兔抗鼠CD68 (Proteintech)、Act 1 (Santa Cruz)、FITC(Life Technologies)標記二抗。

1.3 統計學數據分析

對上述所得實驗數據，采用SPSS軟件進行統計分析。以P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 anti-Act 1小鼠的鑒定

Anti-Act 1小鼠基因鑒定的目的條帶為250 bp，如圖1 A所示。基因鑒定為陽性的小鼠，提取腹腔巨噬細胞，提取細胞的蛋白，采用Western blot技術檢測Act 1的表達，結果如圖1B所示，與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠的腹腔巨噬細胞中Act 1的表達有明顯的下調趨勢。

2.2 靶向抑制巨噬細胞Act 1對小鼠肺轉移的影響

造模20 d后，處死小鼠。解剖取材，肉眼大體觀察肺組織的轉移情況。結果如圖2所示，與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠肺表面轉移灶較少。通過統計學分析，具有明顯的下調趨勢且有統計學意義(P< 0.01)。通過HE染色，在顯微鏡下觀察轉移灶，證實了它們與B16細胞的同源性。

圖1 (A) Anti-Act 1 小鼠基因型鑒定；(B) Western blot 技術檢測小鼠腹腔巨噬細胞Act 1的表達Figure 1 (A) Genotype characterization of the anti-Act 1 mice；(B) Act 1 expression in peritoneal macrophages as determined by western blotting

注：與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠體內肺結節數減小，**P<0.01。圖2 C57和anti-Act 1小鼠肺部腫瘤轉移的情況(×10)Note.Compared with C57 mice, the number of lung nodules in anti-Act 1 mice were decreased, **P< 0.01.Figure 2 Comparison of lung metastasis in the lung tissues of C57 and anti-Act 1 mice

2.3 靶向抑制巨噬細胞Act 1對小鼠肺組織B16-F10腫瘤細胞增殖的影響

細胞增殖指數是評價腫瘤嚴重程度的關鍵因素，Ki67可以反映細胞增殖的情況。免疫組化的結果如圖3所示，與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠的Ki67的表達量明顯減少。通過統計增殖指數(陽性細胞數/總細胞數)，結果顯示anti-Act 1小鼠的腫瘤細胞增殖程度低于C57小鼠，且具有統計學差異(P< 0.01)。

注：與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠體內Ki67表達量下降，**P< 0.01。圖3 C57和anti-Act 1小鼠肺部腫瘤細胞增殖情況(×10)Note.Compared with C57 mice, the expression of Ki67 in the anti-Act 1 micewere decreased, **P< 0.01.Figure 3 Tumor cell proliferation in the metastatic lung lesions of C57 and anti-Act 1 mice

2.4 靶向抑制巨噬細胞Act 1對小鼠肺組織炎癥細胞浸潤的影響

免疫組化的結果如圖4所示，白細胞標記物CD45和巨噬細胞標記物CD68主要表達于肺轉移灶的腫瘤實質部位。與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠的CD45和CD68的表達量明顯減少，且均具有明顯的統計學差異(P< 0.01)。結果提示，白細胞和巨噬細胞在腫瘤轉移部位的浸潤數量明顯減小。免疫熒光的結果如圖5所示，在C57小鼠肺轉移灶中，Act1與巨噬細胞的標記物CD68均有表達，且有大量共定位；然而，在anti-Act 1小鼠中，兩者的共定位甚少。進一步證明，在anti-Act 1小鼠的巨噬細胞上Act 1的表達被靶向抑制了，且此類巨噬細胞在腫瘤轉移部位的浸潤數量明顯減小。

3 討論

腫瘤一旦發生轉移，就會對包括化療、放療和免疫療法在內的大多數療法產生耐藥性。遠端轉移的黑色素瘤患者預后極差，中位生存時間僅為8個月[20]。轉移是導致癌癥相關死亡最主要的原因之一。腫瘤的發生發展與腫瘤細胞所處環境有密切關聯，腫瘤微環境涉及多種免疫細胞和炎癥因子，巨噬細胞參與其中且與多種腫瘤發生與發展密切相關[21]。Act 1作為IL-17信號通路必需的銜接蛋白，可與IL-17RA和TRAF6形成復合體，活化NF-κB等信號通路[22]。本研究利用巨噬細胞Act 1表達被靶向抑制的小鼠(anti-Act 1)為研究對象，探討與研究了與NF-κB活化相關的Act 1對黑色素瘤肺轉移的影響。

注：與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠體內CD45、CD68表達量均下降，**P< 0.01。圖4 C57和anti-Act 1小鼠肺部炎癥細胞浸潤情況(×20)Note.Compared with C57 mice, the expressions of CD45 and CD68 were decreased in anti-Act 1 mice, **P< 0.01.Figure 4 Inflammatory cell infiltration in the lung tissues of C57 and anti-Act 1 mice

圖5 免疫熒光法檢測小鼠肺轉移灶中巨噬細胞與Act 1的共表達情況(×20)Figure 5 Act 1 expression in the lung-resident macrophages. Immunofluorescence staining

本實驗研究結果表明，在B16-F10的人工肺轉移實驗中，與C57小鼠相比，Anti-Act 1小鼠可顯著抑制轉移灶的數目，同時通過HE染色，顯微鏡下觀察發現，Anti-Act 1小鼠的轉移灶腫瘤組織面積小，片狀壞死部位少，提示靶向抑制巨噬細胞Act 1的表達，具有抗惡性腫瘤轉移的能力。細胞增殖指數是評價腫瘤嚴重程度的關鍵因素，ki67可以反映細胞增殖情況。在anti-Act 1小鼠的肺部轉移灶的腫瘤部位，ki67的表達量明顯降低，表明抑制巨噬細胞Act 1的表達能明顯抑制腫瘤轉移部位的細胞增殖。Anti-Act 1小鼠腫瘤的惡化程度較低，這也進一步說明了抑制巨噬細胞Act 1的表達能在一定程度上減慢腫瘤細胞向肺轉移的速度。腫瘤組織中TAM浸潤與腫瘤發展以及不良預后相關，TAM可分泌TNF-α、EGF、IL-6等因子促進腫瘤細胞的增殖與存活[23]。同時，也觀察到，在腫瘤轉移灶部位及其周圍，白細胞和巨噬細胞的浸潤明顯減少。實驗結果表明抑制巨噬細胞Act 1的表達，能夠減緩腫瘤微環境中炎癥細胞的浸潤。

綜上所述，靶向抑制巨噬細胞Act 1的表達具有抗黑色素瘤肺轉移的效應，這種效應可能是由于抑制了腫瘤細胞的侵襲性和增殖能力，減弱了炎癥因子的浸潤能力。本研究結果為臨床上抗腫瘤轉移治療提供了理論基礎。但其抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的分子機制還有待深入研究。