實驗動物專業技術培訓和教學中強化遺傳質量控制意識

李長龍,陳振文

(首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069)

實驗動物是一類人為控制繁殖方式并具有特殊遺傳組成的動物群體，一般分為同基因型(近交系)和異基因型(封閉群)動物。近交系動物是經連續20代(或以上)的全同胞兄妹交配(或親代與子代交配)培育而成，近交系數大于99%，基因純合度達98.6%以上。同一品系的動物由于始于共同祖先，具有基因型和表型的一致性，因而主要的生物學特性相同，個體間近于無差異，對實驗反應也趨于一致，因此，只需用少量的動物，即可得到非常規律的實驗結果。而封閉群動物則是以非近親交配方式進行繁殖生產的實驗動物種群，要求在不從其外部引入新個體的條件下，至少連續繁殖4代以上。這使得封閉群動物的遺傳組成具有一定的雜合性和穩定性，它類似于人類群體遺傳組成的異質性，在人類遺傳研究、藥物篩選和毒性試驗等方面有重要作用。顯而易見，在近交系動物生產和實驗應用中就十分重視動物的均一性，而封閉群動物個體間則強調其多樣性。但在實際工作中，由于多種原因可以導致動物的遺傳基因或基因頻率的改變，使同一品種品系的動物與原始品種品系出現了明顯的遺傳差異，個體間的均一性大大降低。遺傳質量問題主要發生在實驗動物生產過程中，不但影響實驗動物的生產，還對研究結果的真實性、穩定性和重復性產生極大影響。因此，如何發現和處理實驗動物遺傳質量問題就顯得十分重要。

本課題組前期研究中利用N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導4家公司購買的C57BL/6 J小鼠建立胸腺淋巴瘤模型。盡管所用MNU的劑量和給藥方法均參照了多數國外文獻報道[1]，但4批C57BL/6 J小鼠的實驗結果卻差異極大，死亡率在3.3%～91.7%不等，胸腺淋巴瘤模型成功率0～56.6%(表1)。應用42個微衛星位點對上述群體動物進行遺傳檢測發現動物在群體間和群體內均有微衛星DNA位點多態現出現，表明群體存在遺傳質量問題[2]。

實驗動物專業技術人員和醫學生是未來動物實驗的執行者、管理者和監督者，在培訓和教學過程中強化遺傳質量控制的意識非常重要。本文結合實驗動物管理和應用動物進行科學研究的實際工作經驗，就如何發現、分析和處理實驗動物遺傳質量事件，強化相關人員的實驗動物遺傳質量控制意識，保證實驗動物的遺傳質量，提高動物實驗的真是性和準確性。

1 動物實驗中實驗動物遺傳質量問題的發現與處理

1.1 動物實驗中常見的實驗動物遺傳質量問題

實驗動物遺傳質量是影響研究結果的關鍵因素之一，但是由于實驗動物遺傳質量問題具有滯后性和隱蔽性，加之多數科研人員對此重視程度不夠或沒有意識到，使得遺傳質量對動物實驗結果產生的影響往往被低估。盡管如此，實驗動物遺傳質量問題仍常見于報道之中。學者認為，實驗動物遺傳組成不同是很多生物學和醫藥相關實驗結果差異大或無法重復的主要原因[3]。科學研究中由于應用的實驗動物遺傳質量不好而出現的常見問題主要表現為動物對同樣的實驗處理反應不一致，實驗結果差異很大，實驗結果缺乏真實性、無法重復，甚至出現違背常理現象[4]。

1.2 動物實驗中實驗動物遺傳質量問題的處理方法

在動物實驗中出現異常或實驗結束后結果差異較大時，在排除其他影響因素的情況下，應考慮是否存在實驗動物遺傳質量問題。如果發現個別動物出現遺傳質量問題時，可以考慮淘汰有問題的動物，重新補充新的動物進行實驗。當出現有較多動物遺傳質量問題時，須淘汰所有動物，從其他生產單位重新購入動物進行實驗。考慮到樣本和時間因素，最好先從小樣本預實驗開始，之后再擴大樣本。當懷疑實驗動物存在遺傳質量問題時，可以活體采取少量組織(尾或血液)提取基因組DNA，用微衛星或SNP位點進行檢測，通過分析結果判定是否存在遺傳質量問題而采取相應的措施。

表1 不同群體小鼠模型制作結果比較

1.3 動物實驗中遺傳質量控制注意事項

動物實驗前應首先了解動物生產供應單位情況，選擇管理規范、注重質量、信譽良好并且在同類實驗研究應用較多的單位采購。也可以通過向做過同類實驗的同行進行咨詢。了解生產供應單位最近一次遺傳檢測時間和結果，要求生產供應單位提供遺傳質量檢測報告。動物購入后應檢查動物外觀，包括毛色、體型、采食量和飲水量是否一致，不合格動物不能編入實驗組。

2 實驗動物生產中動物遺傳質量問題的發現與處理

2.1 實驗動物生產中常見的動物遺傳質量問題表現

實驗動物遺傳質量改變有的并不表現出可見的表性特征，需要進行特殊的實驗室檢查才能發現。但多數情況下通過細心觀察或多代繁殖后會顯現出可見或可感知的異常變化。一般可觀察到的與遺傳質量有關的變化如下幾個方面，在外部表型特征方面(包括：毛色、眼睛、尾巴、乳頭數、生殖器、牙齒、耳和四肢等)、繁殖特性(包括：妊娠率、產子數、胎間隔、離乳率、食仔、拒絕哺乳、死胎或畸形等)、生長發育特性(包括：初生重、離乳重、體長、尾長等)以及生理生化等指標等。對于外部特征沒有顯著變化的遺傳質量改變，只能通過定期的遺傳質量檢測才能發現。

2.2 實驗動物生產中遺傳質量問題產生的可能原因分析

近交系動物遺傳質量問題通常有以下原因。首先，種源問題。目前應用的近交系實驗動物品系大多來源于國外，國內實驗動物飼養機構原則上從國家實驗動物種子中心引種后進行繁育，多數單位自行保種繁殖。如果種子動物遺傳質量出現了問題而未被發覺，將會導致生產的動物遺傳質量出現問題。第二，繁殖方式問題。近交系動物的核心種群必須采用全同胞近親繁殖，在生產群體中則可采用隨機交配的方式進行，但限于繁殖4代之后全部淘汰，不得留種。如果生產群隨機交配超過4個世代，動物遺傳質量出現問題的概率將大大增加。第三，遺傳污染。很多近交系動物在外部形態特征上很難區分，如果飼養管理稍有疏忽將可能導致不同近交系動物雜交，進而出現遺傳質量問題。此外，雜合基因顯現、基因突變、保種時間過長等原因也能引起近交系動物遺傳質量問題。

封閉群動物遺傳質量問題的原因主要有以下幾個方面。首先，封閉群動物種群規模過小導致近交系上升過快(每代超過1%)，群體出現近親繁殖而導致近交衰退。第二，繁殖方式不合理。由于繁殖方式不合理(非隨機交配或循環交配)導致近親繁殖，從而出現動物遺傳質量下降。第三，引種不規范。一般小型嚙齒類動物引種有效規模不小于25對，如果引種規模過小則導致近交系數過快上升，易于出現近親繁殖現象。此外，外部動物種群進入、選種指標不完善、選擇壓力過大、生產記錄管理混亂等也是出現遺傳質量問題的重要因素。

2.3 實驗動物生產中動物遺傳質量問題的處理方法

當僅有個別動出現遺傳質量問題時，對無培育和應用價值的異常動物進行淘汰。如果出現遺傳質量問題的動物具有培育和應用價值，如有某種疾病表型，則應找到同窩(最好有相同表型)動物或親代進行繁殖，觀察其是否具有遺傳性，固定其表型，進而建立新的模型動物種群。當多數動物出現遺傳質量問題時，則應首先對有問題的動物進行抽樣檢測。針對近交系群體主要進行一致性檢測，明確遺傳質量問題。對個別動物出現多態性差異，應對其親代動物進行檢測，確認后淘汰這一支的所有動物。較多動物出現不均勻的改變時，淘汰種群，重新引種。對于封閉群動物主要進行均勻性檢測以確定群體內是否處于平衡狀態，與原群體是否存在差異。如有較大差異，查找原因，是否有新的動物引入，是否種群過小。對問題較多的種群要進行淘汰，重新引種并封閉繁育4代以上。

2.4 實驗動物生產中控制動物遺傳質量應注意事項

遺傳質量控制貫穿于實驗動物生產的各個環節，引種、繁育、保種和生產中均應嚴格控制。首先，要從國家正規的實驗動物種子中心引種，種用動物要具有明確的品種品系背景資料、遺傳組成、遺傳檢測報告及主要生物學特性等。第二，飼養人員要經過嚴格的標準化管理和操作培訓，考核合格后方可以上崗；飼養人員要善于及時發現問題、分析問題并解決問題。第三，生產過程嚴格生產記錄制度，保證生產記錄完整，包括品系名稱、繁殖代數(系譜)、繁殖方式、繁殖狀況、生長發育狀況、異常發生情況等。第四，根據不同品種品系動物的遺傳

特征定期進行遺傳檢測，其中近交系動物應保持遺傳均質性和基因單態性，封閉群動物應保持遺傳異質性和基因多態性并保證近交系數每代上升不超過1%。第四，動物生產單位應建立規范的活體保種和冷凍保種體系，防止種源發生遺傳質量事故。

3 結語

實驗動物遺傳質量是保障實驗動物生產和動物實驗結果可靠性的重要因素，但在實際工作中由于動物遺傳質量問題產生的效果延遲和難于發現等原因，使實驗動物的遺傳質量問題長期存在。另外，實驗動物生產管理者和實驗動物使用者每當談到實驗動物的質量時，更多地重視實驗動物的微生物學和寄生蟲學質量，往往忽略遺傳質量問題。實際上遺傳質量與微生物質量一樣都會對實驗動物產生重要影響，遺傳質量控制某種程度上甚至比微生物質量控制更重要。實驗動物遺傳質量問題不但導致動物生產群體的質量下降，而且也是動物實驗結果無法重復的重要原因[5]。實驗動物專業技術人員培訓和實驗動物教學過程中培養學生實驗動物遺傳質量控制的意識是十分必要的。在培訓和教學過程中通過理論和實例的講解，強化對實驗動物遺傳質量控制重要性的認識，培養他們善于發現實驗動物遺傳質量問題，找出問題的根源，提出解決問題的辦法。