依達拉奉對缺氧缺血性腦病新生大鼠腦水腫及CD163/HO-1信號通路的影響

韓遵華，段 淼，李清香

(貴州省遵義市第一人民醫院新生兒科，貴州 遵義 563002)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒在圍生期因缺氧而引起的缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage，HIBD)，臨床上常表現為意識障礙、腦水腫、高顱壓、肌張力改變等神經系統癥狀[1]。腦水腫、出血是新生兒HIE早期重要的病理變化，也是導致病情進展和惡化的重要因素[2]。清道夫受體蛋白CD163/HO-1(heme oxygenase-1)信號通路在血紅蛋白(haemoglobin，Hb)分解代謝中起著關鍵作用，還具有抗脂質過氧化和抗炎作用[3-4]。研究發現，CD163、HO-1在腦出血所致腦損傷組織中的表達明顯升高，可促進腦水腫吸收，減輕腦組織損害[5]。依達拉奉是一種自由基清除劑，主要用于治療腦梗塞急性期患者，它可通過清除自由基，避免脂質過氧化，抑制腦、血管內皮和神經細胞的氧化損傷，進而緩解腦缺血引起的腦水腫、腦梗塞[6]。但依達拉奉是否可用于治療新生兒HIE尚無具體報道。因此，本研究通過建立新生大鼠HIBD模型，探究依達拉奉對HIE新生大鼠腦水腫及CD163/HO-1信號通路的影響，以期為依達拉奉臨床應用提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級7日齡SD新生大鼠11窩共120只，體重12～16 g，雌雄不限，由重慶第三軍醫大學野戰外科研究所動物室提供[SCXK (渝) 2012 - 0001]，飼養于SPF級實驗室[SYXK (渝) 2017-0012]。飼養的環境溫度: (22±2)℃，相對濕度 50% ～ 60%，光照 12 h /12 h 明暗交替，每籠 5 只。實驗過程中按實驗動物使用的 3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

550D數碼相機(日本佳能公司),Image J軟件(National Institutes of Health，美國)；GIS-2020數碼圖像分析系統(寧波新芝生物科技股份有限公司)。依達拉奉注射液(規格號：國藥準字H200502820，購自南京先聲東元制藥有限公司)，Rat Brain Matrix(Zivic Instruments，USA)；2,3,3-三苯基氯化四氮唑(TTC，美國Sigma-Aldrich公司)；NCBI Primer Blast設計定量引物序列(由上海生工生物工程有限公司合成)；RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；反轉錄試劑(寶生物大連公司)；實時熒光定量PCR儀(Beckman Couhe公司)；組織蛋白提取試劑(南京凱基生物公司)；BCA法進行蛋白定量(南京建成生物工程研究所)；硝酸纖維素膜(上海基因公司)；β-actin兔抗大鼠IgG溶液(美國Sigma公司)；二抗稀釋液(1∶1000堿磷酶標記山羊抗兔IgG溶液，美國Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立

根據Rice等[7]方法建立HIBD模型，將7日齡SD新生大鼠麻醉后，仰臥固定于手術臺，頸部用75%酒精消毒，于頸部正中切口，游離左側頸總動脈并在遠、近心端進行雙結扎，縫合傷口并消毒后放回母鼠旁恢復2 h。然后將新生大鼠放入的缺氧玻璃艙內，缺氧艙浸泡在37℃恒溫水浴中，同時向艙內不斷通入8% O2和92% N2混合氣體，持續缺氧2 h。最后將新生大鼠放回母鼠處繼續喂養。假手術組新生大鼠只游離左側頸總動脈穿線但不結扎，縫合傷口后不進行缺氧處理。

1.3.2 分組與給藥處理

將術后的90只HIBD新生大鼠隨機分為依達拉奉治療組(即依達拉奉組)和模型組各45只，另取30只新生大鼠行假手術作為假手術組。各組又分為6個亞組即6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d組。將依達拉奉注射液用生理鹽水(體積比1∶4)稀釋為0.3 mg/mL，依達拉奉組在術后立即給予腹腔注射依達拉奉2 mg/kg，間隔24 h給藥1次，連續5 d。模型組和假手術組給予腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.3 腦組織標本的處理

各組新生大鼠在術后相應時間點斷頭取出腦組織，用10%多聚甲醛在室溫下固定24 h，沿左側腦組織視交叉處冠切，做成石蠟包塊，連續冠狀切片，進行相關檢測。另取每組新生大鼠左側腦組織于液氮中凍存，待標本集齊后進行后續qRT-PCR和Western blot實驗。

1.3.4 2,3,5-三苯基四氮唑一水合物(TTC)染色

造模后24 h，各組隨機取4只新生大鼠斷頭取出腦組織，浸泡在4℃ 0.15 mol/L PBS中5 min，采用Rat Brain Matrix沿大腦冠狀面進行切片，切片厚2 mm；將切片浸泡在含2%TTC的0.15 mol/L PBS中，室溫孵育30 min；用4℃ PBC沖洗兩遍后，于4℃ 10%福爾馬林緩沖液中避光固定。照相后，用Image J 1.8.0軟件測量梗死面積。紅色為正常腦組織，白色為梗死區腦組織。統計參數用梗死面積占同側腦半球總面積百分比來表示。

1.3.5 腦組織含水量測定

用干濕比重法[8]進行測定，每組新生大鼠在術后時間點處死，斷頭開顱后迅速將腦組織取出，用電子天平稱腦組織濕重(精確到0.1 mg)。然后置于100℃恒溫烘箱中24 h左右，待質量恒定后稱腦組織干重。按Elliot公式，腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。腦水腫程度用腦含水量來表示。

1.3.6 qRT-PCR實驗

以β-actin作為內參基因，用NCBI Primer Blast設計定量引物序列，引物序列如下：

CD163：上游引物(5′ to 3′)：AGCATGGAAG CGGTCTCTGTGATT，下游引物(5′ to 3′)：AGCTG ACTCATTCCCACGACAAGA。HO-1：上游引物(5′ to 3′)：A CCGCCTTCCTGCTCAACAT，下游引物(5′ to 3′)：GGGCGTCTCTGCAGAGGTAG。β-actin：上游引物(5′ to 3′)：TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT，下游引物(5′ to 3′)：CACGATGGAGGGGCCGGA CTCATC。

取出每組液氮凍存的腦組織，利用Trizol法提取RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用紫外分光光度計檢測其純度及濃度。取1 μg總RNA，用反轉錄試劑合成cDNA。合成cDNA第一鏈后，取5 μL cDNA(稀釋20倍)為模板，加入10 μL 2×SYBR Green qPCR Super Mix、0.5 μL GAPDH(或CD163、HO-1)上下游引物、4.0 μL ddH2O至20 μL，在實時熒光定量PCR儀上擴增。反應條件：預變性95℃ 30 s；擴增40個循環95℃ 5 s，60℃ 35 s。實驗進行3次生物學重復。采用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR結果，ΔCT=CT目的基因- CT內參基因，ΔΔCT=ΔCT目的基因- ΔCT內參基因。

1.3.7 Western blot分析

取每組大鼠腦組織充分研磨，用組織蛋白提取試劑常規提取蛋白。每組取4 μL蛋白樣品，用BCA法進行蛋白定量，調節好蛋白濃度；將蛋白樣品與等體積2× SDS緩沖液混合后加熱變性；接著通過SDS-PAGE電泳分離上清液；把分離的蛋白質轉印到硝酸纖維素膜上；將膜洗滌后在5%牛血清蛋白溶液中室溫封閉1 h；洗滌后將膜置于一抗稀釋液(1∶100的CD163、HO-1、β-actin兔抗大鼠IgG溶液中，4℃孵育過夜；次晨將膜快速清洗后，轉移到二抗稀釋液中，在室溫下孵育2 h；清洗后用新配制的顯色液進行顯色，待出現清晰的條帶后終止；最后使用GIS-2020數碼圖像分析系統掃描并分析蛋白雜交條帶。

1.4 數據統計分析

2 結果

2.1 SD新生大鼠模型行為觀察

術前所有SD新生大鼠生物學行為正常。術后模型組和依達拉奉組新生大鼠在低氧艙中10～15 min后開始出現煩躁不安；缺氧30 min后呼吸頻率加快，不能站穩，翻滾，逐漸出現全身震顫，不能翻身，夾尾左旋；1 h后出現嗜睡，不愛活動，精神萎靡，少數出現抽搐情況，均未死亡，呈現先興奮后抑制行為。假手術組新生大鼠的行為無明顯異常。造模后置于正常環境，發現模型組新生大鼠癥狀逐漸加重，2～3 d時最為嚴重，6～7 d時癥狀減輕；依達拉奉治療后癥狀也加重，2 d時最為嚴重，但較模型組明顯減輕，3 d內癥狀改善。

2.2 SD新生大鼠腦組織形態觀察

TTC染色結果發現，造模后24 h模型組新生大鼠大腦左半球皮層、海馬、紋狀體等區域出現水腫、顏色蒼白，左半球體積比右半球稍大，而依達拉奉治療后腦組織損傷程度顯著降低。結果見圖1A。經定量分析發現，與假手術組相比，模型組和依達拉奉組新生大鼠大腦左半球梗死面積均顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，依達拉奉治療后腦梗死面積顯著減小(P<0.05)。結果見圖1B。

2.3 SD新生大鼠腦組織含水量變化

術后6 h，與假手術組相比，模型組、依達拉奉組新生大鼠腦組織含水量均明顯升高(P<0.05)，2 d時腦含水量最高。依達拉奉治療后新生大鼠腦組織含水量明顯低于模型組(P<0.05)。結果見表1。

2.4 SD新生大鼠腦組織CD163、HO-1 mRNA表達水平

qRT-PCR結果顯示，與假手術組相比，模型組、依達拉奉組新生大鼠腦組織CD163、HO-1 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05)，在24 h時，CD163 mRNA表達水平達到最高隨后趨于平穩，而HO-1 mRNA表達水平達到最高時逐漸下降。但依達拉奉治療后新生大鼠CD163、HO-1 mRNA表達水平顯著高于模型組(P<0.05)。結果見圖2。

注：A：各組典型腦梗死圖片。B：各組腦組織梗死面積。與假手術組相比，*P<0.05；與模型相比，#P<0.05。圖1 造模后24 h各組SD新生大鼠腦梗死情況(n=4)Note. A，Typical pictures of brain infarct in each group.B, Brain infart area of each group. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with model group,#P<0.05.Figure 1 Infarct size of each group of neonatal rats at 24 h after model establishment

表1 各組SD新生大鼠在不同時間點腦組織含水量變化

注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

注：A：CD163 mRNA表達變化。B：HO-1 mRNA表達變化。與假手術組相比，*P<0.05；與模型相比，#P<0.05。以β-actin作為內參基因。圖2 各組新生大鼠不同時間點腦組織CD163、HO-1 mRNA表達變化(n=6)Note. A，The expressing of CD163 mRNA.B，The expressing of HO-1 mRNA.Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 2 Changes of the expression of CD163 and HO-1 mRNA in each group of the neonatal rats at different time points

2.5 SD新生大鼠腦組織CD163、HO-1蛋白表達水平

Western blot結果顯示，與假手術組相比，模型組、依達拉奉組新生大鼠腦組織CD163、HO-1蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，依達拉奉治療后，新生大鼠CD163、HO-1蛋白表達水平顯著高于模型組(P<0.05)，與qRT-PCR結果一致。結果見圖3。

注：與假手術組相比，*P<0.05。與模型組相比，#P<0.05。圖3 各組新生大鼠不同時間點腦組織CD163、HO-1蛋白表達變化(n=6)Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 3 Changes of the expression of CD163 and HO-1 proteins in each group of the neonatal rats at different time points

3 討論

新生兒HIE是圍生期的常見病，其發病率僅次于新生兒黃疸和肺炎，易造成新生兒死亡，且幸存兒常伴有智力低下、腦癱、癲癇等神經系統后遺癥[8-11]。研究發現腦組織缺氧缺血后，花生四烯酸被環加氧酶、脂氧化酶氧化是引起腦損傷的初步反應，進一步導致氧自由基、一氧化氮、炎癥因子等產生增加，胞膜脂質被過度氧化，膜上離子泵遭到破壞，鈉離子、鈣離子、水分子等進入胞內，導致神經細胞水腫、凋亡以及壞死[12-13]。新生兒HIE目前尚無既安全又有效的治療手段，因此根據其發病機理尋找新的治療藥物尤為重要。

依達拉奉是臨床常用的腦保護劑，其在治療急性腦梗死、腦出血及其相關疾病具有很好的療效，它可通過清除自由基防止脂質過氧化；保護腦組織、血管內皮免受氧化損傷，從而減輕腦缺血引起的腦水腫、腦梗塞[14-15]，故在理論上它能夠治療新生兒HIE。本研究參照Rice等[7]HIBD模型經典創建方法，選用與新生兒神經發育類似的7日齡新生大鼠，術后缺氧過程中新生大鼠出現呼吸加快、發紺、站立不穩，隨后新生大鼠行為能力發生障礙，夾尾旋轉；顯微鏡觀察發現結扎側大腦形態異常，出現腦含水量增加，腦組織腫脹，腦梗死等。與前人造模結果[7]一致。經依達拉奉治療HIBD新生大鼠后，上述行為學癥狀明顯改善；模型組新生大鼠大腦左側腦含水量顯著增加，腦腫脹程度嚴重，梗死區域較大，而依達拉奉治療后左側腦含水量顯著減少，腦腫脹程度減輕，梗死面積顯著減小，說明依達拉奉治療能明顯減輕HIBD新生大鼠腦水腫、腦梗死程度。

研究發現，缺氧缺血腦損傷組織中CD163、HO-1的表達明顯增加[16-17]。CD163屬于富半胱氨酸清道夫受體家族(SRCR)成員，通常分布于單核-巨噬細胞膜表面，在單核細胞發育成巨噬細胞過程中，其表達持續上升。小膠質細胞在生理條件下不表達CD163，在受到Hb刺激后才開始表達CD163。血漿中Hb的主要結合蛋白是觸珠蛋白(Hp)，Hb-Hp結合物能被單核或巨噬細胞膜上CD163受體攝入胞內，其在內質體中分解為強氧化物——血紅素，其生成后可由內質體轉移至溶酶體，血紅素氧化酶(HO)可催化其代謝為亞鐵離子、一氧化碳以及膽綠素，血紅素具有很強的神經毒性，易造成繼發性腦損傷。HO包括兩種亞型：HO-1和HO-2，腦損傷后HO-1在神經系統起關鍵作用，因此腦損傷后CD163/HO-1途徑為Hb分解代謝的重要途徑[18-19]。在正常生理條件下，每天約10%紅細胞發生退化，退化紅細胞內的Hb可通過CD163/HO-1途徑分解清除。然而，在病理條件下，CD163/HO-1途徑分解Hb的作用加強，CD163、HO-1在腦損傷引起的腦水腫組織中的表達明顯增加[20]。此外，CD163還具有抗脂質過氧化、抗炎作用[21]。因此，本研究通過雙結扎新生大鼠左頸總動脈并缺氧制作HIBD模型，比較依達拉奉治療組和模型組中腦水腫組織周圍CD163與其下游蛋白HO-1的轉錄和蛋白表達變化，對依達拉奉治療與腦水腫組織CD163、HO-1轉錄和蛋白表達的相關性做了基本的研究和探討。本研究結果顯示模型組、依達拉奉組新生大鼠腦組織中CD163、HO-1的表達水平顯著高于假手術組，而且依達拉奉治療后新生大鼠腦組織中CD163、HO-1的轉錄和蛋白表達水平明顯高于模型組，說明依達拉奉可能通過激活CD163/HO-1信號通路來減輕HIBD新生大鼠腦水腫、腦梗死程度。這充實了CD163/HO-1途徑在缺氧缺血腦損傷方面實驗研究，為依達拉奉臨床治療新生兒HIE提供了實驗依據和理論指導。

模型組新生大鼠腦損傷組織中CD163、HO-1 mRNA和蛋白表達水平顯著增加；依達拉奉治療后新生大鼠腦組織中CD163、HO-1的轉錄和蛋白表達水平明顯增高，且依達拉奉治療能明顯減輕HIBD新生大鼠腦水腫、腦梗死程度。新生兒HIE發生發展的相關因素很多、相關機制復雜，依達拉奉最終在臨床上能否治療新生兒HIE，還需繼續深入的研究。