高蛋白高鈣飲食合并限制飲水建立鵪鶉痛風模型初探

王海鴿，林志健，張 冰，李高璽，王 笑

(北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029)

人類在進化過程中發生了基因突變，缺乏尿酸氧化酶，以尿酸為嘌呤代謝終產物，使得人類血尿酸水平遠高于其他哺乳動物，從而易患高尿酸血癥及痛風[1]。而禽類肝不含精氨酸酶和氨甲酰磷酸合成酶，攝入的蛋白質最終也以尿酸的形式自腎排出，與人類尿酸代謝更加接近。禽痛風是一種發病率較高的禽類常見疾病[2-3]，國內外多有報道，高蛋白、高鈣的營養性因素可引發禽類痛風，導致禽類出現關節腫脹、運動障礙、內臟尿酸鹽沉積甚或大批量死亡等[4-6]。實驗常用的嚙齒類動物等具有尿酸酶，可將尿酸降解成尿囊素排出體外，尿酸酶缺失鼠造價昂貴。常用的實驗模型僅能模擬關節痛風癥狀[7]，與人類痛風發病機理不相一致。以禽類作為痛風模型動物，建立模擬臨床飲食誘導的鵪鶉痛風模型，從尿酸代謝途徑的相似性、操作的簡便性、經濟性等方面均具有優勢。

本實驗模擬臨床發病病因，以酵母、骨粉作為高蛋白、高鈣日糧添加劑飼喂迪法克鵪鶉，并對比自由飲水和限制飲水，探討高蛋白高鈣日糧及飲水量對鵪鶉尿酸代謝及痛風發生的影響，以期建立穩定持久、操作簡便、適合大批量實驗的痛風模型，為痛風的基礎及藥物開發研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級雄性迪法克鵪鶉36只，30日齡，體重(150±10)g，均購自北京市徳嶺鵪鶉養殖場[SCXK(京)110113600218082]。鵪鶉購入后，飼養于北京中醫藥大學普通級動物實驗室[SYXF(京)2016-0038]。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。倫理審查證號：1100000013479。飼養環境：室溫20℃～25℃，相對濕度40%～60%，光照12 h明，12 h暗。

1.2 主要試劑與儀器

造模添加劑：酵母浸膏粉(批號：1349145-02；500 g)，購自北京化學試劑公司；骨粉(批號：20180301；500 g)，購自衡水愛寵商貿有限公司。

檢測試劑盒：尿酸測定試劑盒(批號：181361；100T；生產時間：20180109)，購自中生北生物科技股份有限公司；尿素氮測定試劑盒(批號：20180408；96T；生產時間：20180408)、肌酐測定試劑盒(批號：20171124；96T；生產時間：20171124)，均購自南京建成生物工程研究所；尿酸鹽染色試劑盒(批號：20180604；4×50 mL；生產時間：20180604)，購自北京索萊寶科技有限公司。

SHZ88-1型臺式水浴恒溫震蕩器，北京醫療設備廠；3K1S低溫高速離心機，德國Sigma公司；sunrise酶標儀，瑞士TECAN公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱，北京鴻達天矩試驗設備有限公司；Reichert Histo STAT石蠟組織切片機，美國AO公司；Olympus BX53顯微鏡，日本奧林巴斯；Himadzu B1-220H電子天平，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法

對實驗鵪鶉按鵪鶉免疫程序進行免疫，選取36只經常規免疫接種的雄性30日齡、體重相近、血尿酸水平相近的迪法克鵪鶉開展實驗研究(購自北京種禽公司德嶺鵪鶉場)。隨機分為3組，每組12只，即對照組、模型Ⅰ組、模型Ⅱ組。

對照組鵪鶉飼喂基礎日糧(日糧粗蛋白含量21.7%，鈣含量1%)，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組飼喂高蛋白高鈣日糧(日糧粗蛋白含量29.5%，鈣含量7.8%)，對照組和模型Ⅰ組鵪鶉自由飲水，模型Ⅱ組鵪鶉每日限制飲水4 h。日糧除嘌呤和鈣水平之外，其余營養成分均符合美國NRC家禽營養需要標準[8]。日糧組成和主要營養成分見表1。實驗鵪鶉籠養，每日定時喂飼料，并清潔鵪鶉舍。每10 d稱取一次鵪鶉體質量，并于晚8點禁食，于次日早8點頸靜脈取血一次，檢測血清生化指標。每20 d給鵪鶉放入代謝籠，收取24 h鵪鶉糞尿混合物，檢測糞尿上清液生化指標。實驗第50天，鵪鶉頸靜脈取血1.5 mL后處死，取各組鵪鶉腎臟組織固定、石蠟包埋。控制動物房室溫20℃～25℃，濕度40%～60%。光照12 h明，12 h暗。

表1 造模劑配比及營養水平(風干基礎，%)

注：預混料為每千克飼糧提供：維生素A 200000 IU，維生素D3 60000 IU，維生素E 380 mg，維生素K3 56 mg，維生素B1 56 mg，維生素B2 200 mg，維生素B6 60 mg，維生素B12 300 μg，生物素 3 mg，煙酸 600 mg，泛酸鈣 240 mg，葉酸 30 mg，銅 0.2 g，鐵 1.8 g，錳 1.4 g，鋅 1.1 g，硒 6 mg，碘 8.5 g，磷 15～60 g，鈣 100～250 g，氯化鈉 50～150 g，氨基酸 28 g。

Note. The premix provides the following nutrients per kg diets: VA 200000 IU, VD3 60000 IU,VE 380 mg, VK3 56 mg，VB1 56 mg，VB2 200 mg, VB6 60 mg，VB12 300 μg，biotin 3 mg，niacin 600 mg，pantothenic acid 240 mg，folic acid 30 mg，Cu 0.2 g，Fe 1.8 g，Mn 1.4 g，Zn 1.1 g，Se 6 mg，I 8.5 mg，P 15～60 g， Ca 100～250 g，NaCl 50～150 g， amino acids 28 g.

1.3.2 一般狀態觀察

實驗期間每天定時稱量耗料量；每10 d稱重一次，每次稱重時間保持一致；每10 d測量一次動物踝關節周徑，用軟線環繞鵪鶉踝關節三周，連續測量3次，保證每次測量時間及位置一致，以測量區軟線長度平均值的1/3作為鵪鶉踝關節周徑。踝關節腫脹度(%)=(測量日踝關節周徑-實驗前踝關節周徑)/實驗前踝關節周徑×100%。計算各組鵪鶉平均采食量、體重和關節腫脹度。實驗期間每日觀察鵪鶉的精神狀態、食欲、糞便情況、運動狀態等。

1.3.3 腎病理變化及尿酸鹽沉積

實驗持續30 d結束，對動物禁食不禁水12 h后，空腹采血2 mL，處死動物，取動物腎樣本，進行固定、包埋、切片、HE染色、尿酸鹽染色。觀察動物腎病理形態及尿酸鹽沉積狀況。

1.3.4 血清生化指標

實驗開始前采集鵪鶉血液，檢測血清尿酸水平，記錄鵪鶉初始尿酸水平。實驗期間，以10 d作為一個周期動態觀測鵪鶉血清尿酸、肌酐、尿素氮水平。即每10 d對動物禁食不進水12 h后，空腹頸靜脈采血1.0 mL，靜置3 h后，4℃ 3500 r/min離心10 min，分離血清。在半自動生化儀上，以酶比色法測定鵪鶉血清尿酸、尿素氮、肌酐水平。

1.3.5 糞尿生化指標

實驗第20天對鵪鶉進行一次代謝收集，收集其糞尿混合物，充分震蕩，4℃ 3500 r/min離心10 min，分離上清液。在半自動生化儀上，以酶比色法測定鵪鶉血清尿酸水平。

1.4 統計學方法：

2 結果：

2.1 造模期間鵪鶉痛風癥狀

由表2、表3、表4、圖1可知，實驗期間對照組鵪鶉體重、日均采食量平穩上漲；踝關節未見明顯腫脹；毛色鮮亮、有光澤；鳴叫聲嘹亮；活潑好動，其精神狀態、行為狀態良好。模型Ⅰ組鵪鶉體重較對照組高，一般狀態良好，與對照組相較無顯著性差異。模型Ⅱ組鵪鶉鵪鶉體重、日均采食量平穩上漲；可見踝關節明顯腫脹，實驗第10天，顯著性高于對照組(P<0.05)，實驗第20～50天踝關節腫脹度極顯著性高于對照組(P<0.01)；毛色鮮亮、有光澤；鳴叫聲嘶啞；部分鵪鶉出現懶動喜臥、跛足、足趾變型等癥狀。

2.2 造模后鵪鶉腎病理變化及尿酸鹽沉積狀況：

鵪鶉腎臟病理切片HE染色400倍光學顯微鏡下可見對照組鵪鶉腎組織結構清晰，細胞核藍染，細胞漿均勻紅染，腎小球、腎小管結構正常。模型Ⅰ組鵪鶉腎組織結構未見明顯異常，組織結構清晰，腎小管上皮細胞形態正常。模型Ⅱ組鵪鶉腎組織結構清晰，細胞漿疏松、不均勻紅染，部分腎小球萎縮，腎小管管腔擴張。見圖2。

鵪鶉腎尿酸鹽染色400倍光學顯微鏡下可見，對照組鵪鶉腎組織未見黑色尿酸鹽結晶。模型Ⅰ組鵪鶉腎組織明顯可見黑色的尿酸鹽結晶沉積于腎小管周圍。模型Ⅱ組鵪鶉腎組織顯著可見大量黑色尿酸鹽結晶沉積于腎小管周圍。見圖3。

2.3 造模期間鵪鶉尿酸水平

由表5、表6可見，實驗期間，與對照組相比，模型Ⅰ組鵪鶉于實驗第20 d血清尿酸水平顯著性高于對照組(P<0.05)，實驗第30～50天血清尿酸水平均極顯著性高于對照組(P<0.01)；模型Ⅱ組鵪鶉于實驗第10～50天血清尿酸水平均極顯著性高于對照組(P<0.01)。其余各組血清尿酸水平與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

實驗期間，與對照組相比，模型Ⅰ組鵪鶉于實驗第20天糞尿尿酸水平顯著性低于對照組(P<0.05)；模型Ⅱ組鵪鶉于實驗第40天糞尿尿酸水平顯著性低于對照組(P<0.05)，實驗第20天糞尿尿酸水平極顯著性低于對照組(P<0.01)。

表2 高蛋白高鈣日糧對鵪鶉體重的影響

表3 高蛋白高鈣日糧對鵪鶉采食量的影響

注：與同期對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。下表同。

Note: Compared with the control group at the same day,*P<0.05,**P<0.01.The same in the following tables.

表4 實驗期間各組鵪鶉右足踝關節腫脹度(%，n=12)

表5 高蛋白高鈣日糧對鵪鶉血清尿酸水平的影響

組別Groups20天20 d 40天40 d對照組 Control group33281.32±6344.9318412.57±4528.81模型Ⅰ組 Model group I24443.98±11095.04?16726.30±4641.35模型Ⅱ組 Model group II16730.43±11415.54??14102.99±4388.33?

注：與同期對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。

Note. Compared with the control group of the same at the same day,*P<0.05,**P<0.01.

圖2 鵪鶉腎HE染色病理切片(×400)Figure 2 Histological changes of the quail renal tissues(HE staining)

圖3 鵪鶉腎尿酸鹽染色病理切片(×400)Figure 3 Pathological changes of the quail renal tissues(Urate staining)

表7 高蛋白高鈣日糧對50 d鵪鶉血清炎性

2.4 鵪鶉血清炎性因子表達情況

由表7可見，實驗第50天模型Ⅱ組鵪鶉血清炎性因子IL-1β和TNF-α水平顯著性高于對照組(P<0.05)，模型Ⅰ組鵪鶉血清IL-1β和TNF-α水平與對照組無顯著差異。

2.5 造模期間鵪鶉血清肌酐、尿素氮水平

由表8和表9可見，與對照組相比，模型Ⅰ組血清尿素氮水平無顯著性差異(P>0.05)。模型Ⅱ組鵪鶉于實驗第30天、40天，血清尿素氮水平顯著性高于對照組(P<0.05)。

表8 高蛋白高鈣日糧對鵪鶉血清尿素氮水平的影響

表9 高蛋白高鈣日糧對鵪鶉血清肌酐水平的影響

實驗期間，與對照組相比，模型Ⅰ組血清肌酐水平無顯著性差異(P>0.05)；模型Ⅱ組鵪鶉于實驗第40天、50天血清肌酐水平顯著性高于對照組(P<0.05)。

3 討論

3.1 高蛋白高鈣攝食合并限制飲水誘導鵪鶉痛風的影響

實驗研究表明實驗期間對照組鵪鶉體重、日均采食量平穩上漲，一般狀態良好。對鵪鶉腎組織切片進行尿酸鹽染色(六胺銀法)，陽性反應時尿酸鹽結晶被染成黑色，底色為粉紅色。由圖3可見，對照組鵪鶉腎組織未見黑色尿酸鹽沉積。

模型Ⅰ組以高蛋白高鈣日糧結合自由飲水干預鵪鶉。該組鵪鶉一般狀態與對照組無明顯差異，未見明顯痛風癥狀。血清尿酸水平顯著升高，同時糞尿尿酸水平顯著降低。該組鵪鶉腎組織可見少量尿酸鹽沉積于腎小管周圍。因為鵪鶉肝缺少精氨酸酶，蛋白質只能通過嘌呤核苷酸循環生成嘌呤，而后在黃嘌呤氧化酶的作用下以尿酸作為代謝終產物排出體外[9]。以酵母浸膏作為高蛋白食餌飼喂鵪鶉，為尿酸的合成提供的更多的原料，引發鵪鶉高尿酸血癥。鵪鶉具有特殊的生理結構，消化管、輸尿管和生殖管末端匯合于泄殖腔，故鵪鶉糞尿排泄物中尿酸含量可反映鵪鶉排泄尿酸的能力，由于在血尿酸水升高同時糞尿尿酸水平降低，認為高蛋白高鈣日糧對尿酸的排泄有抑制作用。腎是鵪鶉排泄尿酸的唯一通道，腎臟結構功能的改變直接影響尿酸排泄，長期處在高鈣環境下會引起腎小球腫大、數量減少、腎小管急性細胞損傷等[10-11]，因此認為高鈣日糧的添加可能通過造成鵪鶉腎損傷進而抑制尿酸排泄。因此在實驗期間內，鵪鶉攝食蛋白質含量為29.5%，鈣含量為7.8%的高蛋白高鈣日糧，可增加鵪鶉尿酸生成、減少排泄，導致鵪鶉高尿酸血癥并有少量尿酸鹽沉積于腎，未見明顯痛風癥狀。

模型Ⅱ組鵪鶉攝食高蛋白高鈣日糧結合限制飲水。鵪鶉體重、日均采食量平穩上漲，踝關節腫脹明顯，部分鵪鶉出現懶動喜臥、跛足、足趾變型等痛風癥狀。限制飲水后，其血清尿酸水平極顯著高于對照組，同時糞尿尿酸水平降低。炎性因子白介素-1β和腫瘤壞死因子α顯著升高。病理切片染色后可見腎小管周圍密布黑色尿酸鹽沉積，沉積現象較嚴重。結合血清肌酐、尿素氮結果推測高蛋白高鈣日糧結合限制飲水能導致鵪鶉腎損傷，這可能與腎小管大量尿酸鹽沉積相關。以上結果表明該方法可誘導鵪鶉痛風。尿酸難溶于水而易于與血液中鈣、鈉離子結合形成尿酸鹽，尿酸鹽具有膠體性質在血液中受大量血漿蛋白保護而保持穩定性，但當血液中尿酸水平和鈣離子水平過高時，產生大量尿酸鹽使尿酸鹽溶液的穩定性遭到破壞而發生沉積[12]。飲水量多少與高尿酸血癥及痛風的發生率成反比，飲水量增加、尿量增加，有利于尿酸的排泄從而維持血尿酸濃度穩定。在機體相對缺水狀態下，血液濃縮，會加劇血尿酸濃度升高；尿液濃縮，糞尿排泄量減少，抑制尿酸排泄加劇鵪鶉血尿酸水平的升高；當給鵪鶉攝入相同高蛋白高鈣日糧時，限制飲水后能使鵪鶉血尿酸、血鈣濃度更高，容易聚集在器官、關節等部位形成沉積，誘發痛風發作[13-14]。實驗結果表明，與單純給予高蛋白高鈣日糧的鵪鶉相比，限制飲水之后能使鵪鶉血尿酸水平更高、糞尿尿酸水平更低、腎臟尿酸鹽沉積更顯著，證實限制飲水量之后對鵪鶉尿酸排泄抑制作用更明顯，促進尿酸鹽沉積作用更顯著，可見足夠的飲水量有助于減緩尿酸鹽沉積，減少痛風的發生。匡紅艷等[15]對雞飼喂高鈣日糧、高蛋白日糧、高蛋白高鈣日糧并限制飲水7周，而后改為正常自由飲水，通過對比同一組雞限制飲水前后病理改變也證實限制飲水能導致血尿酸水平升高更顯著，與本實驗結果相一致。

作者前期通過給鵪鶉飼喂含有一定比例酵母浸膏粉和石粉的高蛋白高鈣日糧擬誘導鵪鶉痛風[16]，但實驗結果表明該方法對鵪鶉狀態影響較大，導致鵪鶉一般狀態差甚或死亡的現象，且造模不穩定，僅有部分鵪鶉出現關節腫大等癥狀。而本實驗所造模型較穩定，從踝關節周徑可知模型Ⅱ組鵪鶉踝關節腫大，從血尿酸水平及腎臟尿酸鹽沉積可知模型Ⅱ組血尿酸升高更顯著、尿酸鹽沉積程度更明顯。因此，當給予鵪鶉高蛋白高鈣日糧并同時限制飲水時可誘發鵪鶉痛風。

3.2 鵪鶉痛風模型研究的思考

痛風是長期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起組織損傷的一組異質性疾病。隨著社會經濟的發展和人民生活水平的提高，國民飲食中蛋白質、嘌呤含量的增加，高尿酸血癥和痛風的發病率呈上升趨勢，且呈年輕化趨勢，與多種疾病相關，其發病機理及治療方法的研究成為人們的關注點。建立理想的痛風動物模型是痛風病的病理機制與藥物篩選研究的基礎，國內外學者對此進行了長期的研究，目前已有多種用于研究痛風的動物模型，但至今尚無符合人類痛風發病特點、能反應其病理過程的動物模型，雖然有些靈長類與人類代謝過程十分接近，但在實際情況下，由于條件限制，很難在大規模實驗研究中使用。禽類動物痛風與人類痛風具有高度的相似性，若以禽類作為模型動物研究建立禽痛風模型，對人類尿酸鹽沉積造成的病理損傷、痛風的發病機制及治療藥物篩選研究具有重要意義。

以高蛋白高鈣日糧塑造的鵪鶉痛風實驗模型與人類痛風具有較高的相似性：① 發病原因的相似性。禽類動物痛風與人類痛風均由尿酸生成增多或尿酸排泄減少導致尿酸鹽沉積而引起[17]。均受遺傳、飲食、環境等因素影響，當富含蛋白質、嘌呤等食物攝入過多可引起尿酸生成增多進而易以鈉鹽、鈣鹽等形式沉積，形成痛風。② 臨床表現上的相似性。在臨床表現上，尤其是禽類關節型痛風與人類痛風極為相似，均表現為關節腫脹，且疼痛腫脹多發生于末梢關節，如足趾關節、趾前關節，也可侵害腕關節、腕前關節等處。③ 病理基礎的相似性。禽類與人類均缺少尿酸酶，無法像大多數哺乳動物那樣將嘌呤代謝為可溶性尿素排出體外，均以尿酸為代謝終產物，尿酸難溶于水而易于以尿酸鹽的形式沉積形成痛風。并且禽痛風是一種常見禽病，有較高的發病率和死亡率，因此本實驗欲參照禽痛風的發病規律建立有效、簡便、穩定、經濟的禽痛風模型。

鵪鶉具有體型較小、易于操作，節省空間、適合大規模飼養，價格低廉等優勢。本實驗通過模擬臨床高蛋白高鈣飲食，合并限制飲水，成功誘導出鵪鶉痛風，證明該方法塑造鵪鶉痛風動物模型。但目前實驗塑造的鵪鶉痛風模型尚不穩定，仍需要在操作方法、造模劑種類及劑量的篩選上進一步研究。其次鵪鶉尚未建立微生物控制標準及分級，這在一定程度上阻礙了禽類模型的應用[16]。因此對鵪鶉痛風模型的塑造還需要進一步研究。

致謝衷心感謝導師張冰教授和指導組林志健老師對我的研究思路、實驗操作以及論文撰寫給予的指導和幫助！衷心感謝本課題組李高璽、王雨、白云飛、李凡等同門們在實驗方面給予我的幫助！感謝父母家人對我的關心、支持和理解！