參麥對急性腦梗死小鼠腦組織的保護作用及相關(guān)機制的探討

阮中繁，謝 明*，李 艷，王橋生

(1. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院麻醉科；3. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 衡陽 421000)

急性腦梗死(acute cerebral infarct，ACI)是指腦部供血障礙引起的腦組織壞死，具有較高的致死率和致殘率，嚴(yán)重威脅國民健康[1]。參麥注射液是由紅參和麥冬兩味中藥制備而成的復(fù)方制劑，現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，其具有改善微循環(huán)，增強免疫力，增加腦血流量，降低腦組織耗氧量及清除自由基的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液對于急性腦梗死的治療具有較好的臨床療效，但其機制還尚未明確[3]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)是一類抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，鈣蛋白酶1(calcium activated papain-like cysteine protease-1, calpain-1)是一種降解各種肌肉蛋白的酶[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Bcl-2和calpain均可減輕腦缺血性損傷[6]。因此，本研究通過構(gòu)建急性腦梗死小鼠模型并給以參麥注射液干預(yù)，測定Bcl-2和calpain-1的表達(dá)來探討參麥注射液對其作用及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性CD-1小鼠30只，體重25～30 g，購于南華大學(xué)實驗動物中心[SCXK(湘)2015-0002]，飼養(yǎng)于南華大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境中[SYXK(湘)2015-0001]。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲用潔凈水(均由南華大學(xué)實驗動物中心提供)。飼養(yǎng)環(huán)境： 12 h光照/12 h黑暗，黑暗，濕度恒定，溫度20℃～25℃。所有操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求(倫理審批號：TSME1 2016-001)。

1.2 主要試劑與儀器

A1級MCAO線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)，參麥注射液(神威藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格10 mL×5支，國藥準(zhǔn)字Z13302088)，0.9%氯化鈉注射液(湖南科倫制藥有限公司， 500 mL，國藥準(zhǔn)字H43020454)，4%多聚甲醛(北京索萊寶生物科技有限公司)，Abgent alpain-1單克隆抗體，Bcl-2單克隆抗體(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)，TRIzolTMReagent(購自賽默飛世爾科技中國有限公司)；DAB 顯色試劑盒(北京中杉生物工程有限公司)，TUNEL試劑盒(默克生命科學(xué))。半自動輪轉(zhuǎn)式切片機CUT5062(北京萊比信科技發(fā)展有限公司)，ND-2000超微量分光光度計(北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司)，光學(xué)顯微鏡(北京博恒遠(yuǎn)科技有限公司)，超低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型構(gòu)建及處理

本實驗以30只成年雄性CD-1小鼠為研究對象，隨機分為對照組、模型組和實驗組，每組各10只。按照文獻(xiàn)法[7]構(gòu)建小鼠永久性大腦中動脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)模型，對照組接受假手術(shù)操作1 h后腹腔注射0.3 mL生理鹽水，每天1次；模型組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù) 1 h后腹腔注射0.3 mL生理鹽水，每天1次；實驗組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1 h腹腔注射0.3 mL參麥注射液，每天1次。三組小鼠均干預(yù)2周。

1.3.2 紅細(xì)胞免疫功能指標(biāo)的檢查

采用眼球后靜脈叢采血1 mL置于枸櫞酸鈉抗凝管中，離心取上層血漿備用，從下層取出50 μL紅細(xì)胞加450 μL 0.9%氯化鈉注射液混勻，檢測紅細(xì)胞濃度，加0.9%氯化鈉注射液稀釋至終濃度1.25×107/mL。將凍存致敏酵母菌混勻，將50 μL紅細(xì)胞液與50 μL血漿及50 μL酵母菌混勻，37℃水浴10 min，加入25 μL 0.25%戊二醛，分別取1/2的量以毛細(xì)吸管涂片，吹干，加100 μL甲醇固定后，采用瑞氏染液與緩沖液(1∶3)染色30 s，自來水沖洗3遍后，濕片鏡檢并計數(shù)(與紅細(xì)胞結(jié)合2個以上酵母菌)，得出紅細(xì)胞復(fù)合物花環(huán)形成率(red blood cell- immune complex rosette，RBC-ICR)。同法測定紅細(xì)胞表面C3b受體(RC3bR)。

1.3.3 TUNEL試劑盒檢測各組神經(jīng)元凋亡

制備腦組織石蠟切片，依據(jù)TUNEL試劑盒說明書操作，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腦組織凋亡神經(jīng)元并拍照計數(shù)。

1.3.4 Western blot法檢測calpain-1、Bcl-2蛋白水平的影響

剪取部分腦組織提取總蛋白，調(diào)整蛋白濃度后進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉，清水洗膜后，Abgent calpain-1單克隆抗體或Bcl-2單克隆抗體4℃孵育12 h。洗膜后，室溫孵育熒光標(biāo)記羊抗兔抗體2 h，免疫印跡顯色后進(jìn)行曝光，采用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行分析。

1.3.5 q-PCR法檢測calpain-1、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

剪取部分腦組織，液氮研磨后嚴(yán)格按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，進(jìn)行熒光定量反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組紅細(xì)胞免疫功能比較

與對照組比較，實驗組RBC-C3bR明顯降低，RBC-ICR顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，實驗組RBC-C3bR明顯增高，RBC-ICR顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2 各組腦組織的神經(jīng)元凋亡率比較

對照組小鼠腦組織切片TUNEL陽性細(xì)胞較少，模型組和實驗組小鼠腦組織切片的 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)； 實驗組小鼠腦組織切片的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組小鼠(P<0.05)，見圖1。

2.3 各組腦組織calpain-1、Bcl-2蛋白水平比較

與對照組小鼠比較，模型組和實驗組小鼠的calpain-1蛋白顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組小鼠相比，實驗組小鼠calpain-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖2。

2.4 各組腦組織calpain-1、Bcl-2 mRNA水平比較

與對照組小鼠比較，模型組和實驗組小鼠的calpain-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組小鼠相比，實驗組小鼠calpain-1 mRNA表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖3。

表1 各組紅細(xì)胞免疫功能比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

注：A：對照組；B：模型組；C：實驗組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。下圖同。圖1 各組腦組織的神經(jīng)元凋亡率比較Note. A, Control group. B, Model group. C, Experiment group. Compared with the control group, *P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05. The same in the following figures.Figure 1 Comparison of neuronal apoptosis rates in the brain tissue of each group

注：(1)各組腦組織中Bcl-2、calpain-1蛋白的表達(dá)；(2)各組腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)統(tǒng)計分析；(3)各組腦組織中calpain-1蛋白表達(dá)統(tǒng)計分析。圖2 各組腦組織Bcl-2、calpain-1蛋白水平比較Note. (1) Calpain-1 and Bcl-2 protein levels in brain tissue of each group. (2) Bcl-2 protein levels. (3) Calpain-1 protein levels.Figure 2 Comparison of calpain-1 and Bcl-2 protein levels in the brain tissue of each group

注：(1)各組腦組織中Bcl-2 mRNA水平的統(tǒng)計分析；(2)各組腦組織中calpain-1 mRNA水平的統(tǒng)計分析。圖3 各組腦組織Bcl-2、calpain-1 mRNA水平比較Note. (1) Bcl-2 mRNA levels in brain tissue of each group. (2) Calpain-1 mRNA levels in brain tissue of each group.Figure 3 Comparison of Bcl-2 and calpain-1 mRNA levels in the brain tissue of each group

3 討論

ACI是人類死亡和致殘的主要原因[7]。目前臨床上治療此疾病的主要方式為溶栓治療，由于時間窗較狹窄，因此僅有小部分患者能接受溶栓治療。因此，選擇接近臨床實際情況的腦梗死動物模型進(jìn)行藥物研究具有重要的價值。中藥制劑療效確切、安全性高、價格低廉，已經(jīng)廣泛運用于臨床治療中[8]。參麥注射液主要成分為紅參、麥冬，具有益血生津、補氣滋陰的作用，有文獻(xiàn)報道，參麥注射液可顯著提高急性腦梗死的治療效果，但機制研究較少[9-10]。因此，本研究通過構(gòu)建急性腦梗死小鼠模型并進(jìn)行參麥注射液干預(yù)治療，探討其作用機制。

pMCAO模型具有操作性強和重復(fù)性高的優(yōu)點，是目前國際上應(yīng)用較為廣泛的腦梗死動物模型，模型構(gòu)建成功后可模擬腦梗死的病理過程進(jìn)行缺血后繼發(fā)腦損傷的研究，并且數(shù)分鐘內(nèi)可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及凋亡等一系列繼發(fā)性腦損傷[11]。本實驗通過線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)構(gòu)建pMCAO模型小鼠，目的是研究參麥注射液對模型小鼠紅細(xì)胞免疫功能及凋亡的影響。參麥注射液是由生脈散改變劑型而成，包含人參皂甙、麥冬黃酮等有效成分[12]。人參皂甙可有效改善腦損傷組織的代謝，麥冬黃酮可改善腦細(xì)胞的能量缺乏及缺氧狀態(tài)。參麥注射液被廣泛地運用到心腦血管病、膿毒血癥、腫瘤、膝骨關(guān)節(jié)炎等疾病，并取得較好的療效。在治療腦血管疾病上，陳中明等[13]采用參麥注射液輔助治療急性腦梗死患者，發(fā)現(xiàn)治療后聯(lián)合用藥組明顯改善凝血功能，降低VEGF、GFAP 和 TNF-α水平，提示其具有抗凝、抗炎、改善血液循環(huán)，從而發(fā)揮療效。耿武軍等[14]發(fā)現(xiàn)參麥注射液通過上調(diào)Bcl蛋白和Bcl/Bax比率改善腦缺血再灌注損傷大鼠的腦損傷。紅細(xì)胞免疫是目前免疫學(xué)領(lǐng)域中重要的研究內(nèi)容，研究發(fā)現(xiàn)，機體發(fā)生腦梗死時，RBC-ICR升高，RBC-C3bR降低，從而降低機體的免疫功能[15]。本研究采用參麥注射液對急性腦梗死模型小鼠進(jìn)行干預(yù)治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組RBC-C3bR明顯高于模型組，RBC-ICR顯著低于模型組。結(jié)果表明了參麥注射液能夠改善模型小鼠的紅細(xì)胞免疫功能，與以往研究一致[13]。

Bcl-2家族在在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Bcl-2可通過細(xì)胞凋亡信號途徑阻遏細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命[15]。calpain家族在腦缺血后細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色，研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后1 h，腦部皮層和海馬calpain活性明顯增高，再灌注后24 h calpain活性可再次達(dá)到最高水平[16]。calpain-1是calpain主要的亞家族成員之一，可裂解多種酶，選擇性降解細(xì)胞骨架蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等。calpain-1可通過裂解半胱氨酸蛋白酶Caspases-3、7、8等，并可調(diào)節(jié)Bcl家族介導(dǎo)凋亡。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和實驗組小鼠腦組織切片的 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組，實驗組小鼠腦組織切片的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組小鼠，結(jié)果說明了參麥注射液能夠抑制神經(jīng)元的凋亡。推測其原因可能是參麥注射液具有降低氧自由基，減少腦組織損傷后脂質(zhì)過氧化物生成作用，且可促進(jìn)ATP 合成，提高Na+-K+-ATP 酶活性及膜轉(zhuǎn)運電位，抑制Na+、K+內(nèi)流，減輕腦水腫，發(fā)揮神經(jīng)元的保護作用，抑制神經(jīng)元的凋亡。進(jìn)一步研究其機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠calpain-1蛋白和mRNA表達(dá)水平低于模型組，Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平高于模型組。結(jié)果說明，參麥注射液可通過上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)calpain-1蛋白的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述，參麥注射液可改善急性腦梗死小鼠紅細(xì)胞功能和抑制神經(jīng)元凋亡，其可能的機制是下調(diào)calpain-1蛋白的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，發(fā)揮腦組織神經(jīng)保護作用。