牛冠狀病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

王莎莎，王 吉，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCV)是一類(lèi)具有包膜，基因組為27～30 kb大小的線性單股正鏈的RNA病毒[1]，具有感染性，是所有RNA病毒中最大的。BCV是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，目前冠狀病毒共分為α、β、γ以及新假定的一個(gè)屬共四類(lèi)，牛冠狀病毒和鼠肝炎病毒以及SARS冠狀病毒等同屬β類(lèi)冠狀病毒[2]。BCV與人腸道冠狀病毒4408株在抗原性和基因序列具有很高的相似性，存在潛在感染人的風(fēng)險(xiǎn)。BCV是引起新生犢牛腹瀉和成年牛冬痢、呼吸道疾病的主要病原，在全球普遍流行。BCV經(jīng)常與其他多種病原引發(fā)混合感染，難于診斷，通常需要實(shí)驗(yàn)室病毒分離、血清檢測(cè)或者分子學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行診斷。本研究建立了BCV特異的TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)檢測(cè)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)快速批量檢測(cè)牛群中BCV的感染情況，并減少污染。該方法可應(yīng)用于牛源性生物制品BCV污染的檢測(cè)，為保證生物制品安全性提供依據(jù)，同時(shí)為開(kāi)展BCV基因組的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品與毒種來(lái)源

牛冠狀病毒核酸為哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)，牛藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus，BTV)核酸為第二軍醫(yī)大學(xué)惠贈(zèng)，牛皰疹病毒1型(bovine herpesvirus 1，BHV-1)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus 3, BPIV3)、牛病毒型腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、呼腸孤病毒III型病毒(reovirus 3，Reo3)、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)為本實(shí)驗(yàn)室保存。牛肛拭子63份G1～G63，牛鼻拭子63份B1～B63采集于2016年內(nèi)蒙古牛群，牛源性生物制品33份NY1～NY33為本實(shí)驗(yàn)室2015年應(yīng)急檢測(cè)樣品。

1.2 主要試劑與儀器

FQ-PCR Mix購(gòu)自ABI; FQ-PCR引物探針由ABI公司合成。RNA快速提取試劑盒RNeasy Mini Kit(250)(批號(hào)：154043816)購(gòu)自Qiagen，AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒AMV Reverse Transcriptase(批號(hào)：0000290291)購(gòu)自Promega，TaqMan Universal PCR Master Mix(批號(hào)：1704286)購(gòu)自ABI。熒光定量PCR儀ABI7500 Fast購(gòu)自ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

選擇BCV N 基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物探針，序列如表1所示。

1.3.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

由TaKaRa公司合成BCV(NCBI ID:AF058942)7851～8090 bp的cDNA序列，轉(zhuǎn)入pMD19-T載體中，構(gòu)建BCV FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19-BCVN，濃度為4.0×1010Copies/μL。

1.3.3 病毒cDNA的獲取

將牛冠狀病毒、牛皰疹病毒I型、牛副流感病毒3型、牛病毒型腹瀉病毒、呼腸孤病毒III型、小鼠肝炎病毒；牛肛拭子63份；牛鼻拭子63份；牛源性生物制品33份等樣品按照RNA快速提取試劑盒操作方法進(jìn)行RNA提取。提取的RNA按照Promega AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 BCV FQ-PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

經(jīng)條件優(yōu)化，PCR反應(yīng)體系為：TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，探針引物混合物(10 μmol/L)1 μL，無(wú)RNA酶水7 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

將pMD19-BCVN作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍系列稀釋為109～100copies/μL，將其作為模板，按上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行FQ-PCR反應(yīng)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，選取線性較好的7個(gè)稀釋度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 用于擴(kuò)增N基因的引物與TaqMan探針序列

1.3.5 BCV FQ-PCR檢測(cè)方法的特異性、靈敏性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測(cè)

使用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)BCV、牛皰疹病毒1型、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹瀉病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、小鼠肝炎病毒、牛藍(lán)舌病病毒的病毒核酸，并設(shè)立陰性對(duì)照N/C(空白樣品)檢測(cè)BCV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性；使用4.0×109～4.0×100copies/μL稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行BCV FQ-PCR反應(yīng)，每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行，檢測(cè)方法的靈敏性；用BCV FQ-PCR檢測(cè)方法對(duì)3份不同陽(yáng)性樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，評(píng)價(jià)本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

1.3.6 BCV FQ-PCR污染實(shí)驗(yàn)

將100～10-7梯度稀釋的BCV病毒液和100～10-7梯度稀釋的BCV RNA 0.1 mL與0.2 mL的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子混合后按1.3.3所述方法獲取cDNA，并使用BCV FQ-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其適用性，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。

1.3.7 BCV FQ-PCR的應(yīng)用

使用建立的FQ-PCR方法檢測(cè)63份牛肛拭子，63份牛鼻拭子以及33份牛源生物制品中BCV的感染情況。如有陽(yáng)性結(jié)果，使用PCR引物BCV-PF：5’-CGATGAGGCTATTCCGACTAGG-3’；BCV-PR：5’-GCTTAGTTACTTGCTGTGGC-3’(未發(fā)表)對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送北京英濰捷基公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，以進(jìn)一步驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 BCV FQ-PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用4.0×109copies/μL到4.0×103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板進(jìn)行FQ-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增曲線如圖1，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。擴(kuò)增曲線各稀釋度間距均勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)Slope為-3.417(在-3～-3.5之間)，r2值為0.999(>0.99)說(shuō)明相關(guān)性高，定量結(jié)果有效，擴(kuò)增效率Eff為96.195%(90%-110%之間)。標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差(CTSD值)均小于0.218。

2.2 BCV FQ-PCR特異性檢測(cè)

如圖3所示，建立的BCV FQ-PCR檢測(cè)BHV-1、BPIV3、BVDV、Reo3、BTV均無(wú)S型擴(kuò)增曲線，而B(niǎo)CV有S型擴(kuò)增曲線，CT值為22，陰性對(duì)照無(wú)S型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該方法能特異的檢測(cè)BCV。

2.3 BCV FQ-PCR靈敏性檢測(cè)

如圖4所示，4.0×109～4.0×101copies/μL各稀釋度的3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均有S型擴(kuò)增曲線，101copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的 CT值為34.088，拷貝數(shù)為43.45copies，而100copies/μL的3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)只有1個(gè)實(shí)驗(yàn)有S型擴(kuò)增曲線，CT值>35，說(shuō)明BCV FQ-PCR檢測(cè)方法最小能可靠的檢測(cè)到40copies的樣品。同時(shí)確定該檢測(cè)方法的判定標(biāo)準(zhǔn)為樣品循環(huán)閾值(CT)≤35,同時(shí)拷貝數(shù)(Copies)≥10,判定該樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；循環(huán)閾值(CT) ≥35、拷貝數(shù)(Copies)<10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(Copies)≥10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(Copies)<10,此樣品超出檢測(cè)限，不能確定被檢樣品是陽(yáng)性樣品，結(jié)果判為陰性。

2.4 BCV FQ-PCR準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測(cè)

起始濃度分別為4.0×106copies/μL、4.0×105copies/μL、4.0×104copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品的最終實(shí)測(cè)值的均值分別為4.78×106、3.89×105、3.7×104copies/μL，對(duì)應(yīng)CTSD值分別為0.038、0.113、0.102，CV值分別為0.228、0.547、0.424。3個(gè)濃度梯度3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于5%，表明方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

2.5 BCV FQ-PCR污染實(shí)驗(yàn)

BCV FQ-PCR檢測(cè)BCV病毒液的污染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其檢測(cè)100～10-5稀釋度的CT值平均值分別為21.11、23.51、27.14、30.46、32.16、34.75，10-6BCV病毒液的CT值平均值為37，超出檢測(cè)限。BCV FQ-PCR檢測(cè)BCV RNA污染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其100～10-2稀釋度的CT值平均值分別為25.88、30.17、33.7，10-3BCV RNA的CT值平均值為36.49，超出檢測(cè)限。污染實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明BCV FQ-PCR在檢測(cè)BCV病毒和BCV RNA污染的樣品時(shí)有很好的適用性。

2.6 BCV FQ-PCR的初步應(yīng)用

檢測(cè)63份牛肛拭子、63份牛鼻拭子以及33份牛源生物制品中BCV的感染情況，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。其中僅有1份牛肛拭子G63和2份牛源生物制品NY12、NY17出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，G63的CT值為34.506，NY12、NY17的CT值分別為33.78和34.21。使用1.5中所述的引物進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增后G63、NY12可以得到457 bp比較明顯的擴(kuò)增條帶，測(cè)序結(jié)果在NCBI上比對(duì)，與BCV B1-28F株(NCBI序列號(hào)：KU558923)的同源性為99%，與人冠狀病毒OC43株(NCBI序列號(hào)：KF530072)的同源性為97%。

表2 BCV FQ-PCR初步應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果

圖1 BCV 103～109 copies/μL擴(kuò)增曲線Figure 1 BCV 103～109 copies/μL amplification curve

注：斜率：-3.417 ，Y軸截距：39.686 ，相關(guān)系數(shù)：0.999 ，擴(kuò)增效率：96.195%。圖2 BCV FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Note. Slope: -3.417, Y-lnter:39.686, r2:0.999, Eff%:96.195.Figure 2 BCV FQ-PCR standard curve

注：1：BCV；2-8：BHV-1、BPIV3、BVDV、Reo3、MHV、BTV、N/C。圖3 BCV FQ-PCR特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線Figure 3 BCV FQ-PCR specificity test amplification curves

圖4 BCV FQ-PCR靈敏度檢測(cè)擴(kuò)增曲線Figure 4 BCV FQ-PCR sensitivity test amplification curves

3 討論

BCV檢測(cè)方法有很多，但常規(guī)檢測(cè)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏性差等不足，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。該方法提供了檢測(cè)BCV的FQ-PCR的引物和探針，以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的批量檢測(cè)，有很高的靈敏度和特異性。國(guó)內(nèi)有一些學(xué)者建立了BCV的染料法熒光定量PCR[3],TaqMan探針?lè)ū热玖戏晒舛縋CR特異性更高[4]。

為了準(zhǔn)確檢測(cè)BCV，研究人員選取保守性較高，且與MHV序列差異較大的N基因進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)。所建立的FQ-PCR檢測(cè)方法，以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線各稀釋度間距均勻，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)Slope為-3.417，相關(guān)系數(shù)r2為0.999，擴(kuò)增效率Eff為96.195%。該方法檢測(cè)BCV的敏感度為40 copies，經(jīng)特異性驗(yàn)證確定其對(duì)BHV-1、BPIV3、BVDV、Reo3、MHV、BTV等病毒無(wú)交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測(cè)驗(yàn)證該方法3個(gè)濃度梯度3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于5%，有很好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

污染實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明BCV FQ-PCR在檢測(cè)BCV病毒和BCV RNA污染的樣品時(shí)有很好的適用性。污染實(shí)驗(yàn)中，可以準(zhǔn)確檢測(cè)的BCV病毒稀釋度為10-5，而B(niǎo)CV RNA的稀釋度為10-2，有可能是因?yàn)镽NA在樣品的處理過(guò)程中降解嚴(yán)重，雖然使用了無(wú)RNase的耗材，RNA的降解有可能是使用的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子或者別的一些原因。

2017年北京制定了實(shí)驗(yàn)用牛的地方標(biāo)準(zhǔn)，BCV并未被列入普通級(jí)實(shí)驗(yàn)用牛需要排除的病原體，然而實(shí)驗(yàn)用牛群感染BCV存在一定的病發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，在進(jìn)行使用牛做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)也應(yīng)做全面的考慮[5]。Gomez等[6]對(duì)286份牛糞便樣本進(jìn)行BCV檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在健康牛和腹瀉牛糞便中均能檢測(cè)出BCV核酸，且腹瀉牛糞便樣本的檢出率高于健康牛糞便樣本。建立的BCV FQ-PCR方法在內(nèi)蒙古的健康牛群中檢測(cè)出陽(yáng)性樣本也說(shuō)明BCV在國(guó)內(nèi)牛群中的普遍流行。BCV可引發(fā)冬痢，冬痢的臨床病癥為腹瀉，有時(shí)候便血、發(fā)燒、抑郁、牛奶減產(chǎn)、厭食癥、有時(shí)也咳嗽和流鼻涕，致死性不高，然而B(niǎo)CV感染群體有很高的發(fā)病率，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

使用2次PCR的方法對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行了BCV片段擴(kuò)增，G63和NY12樣品成功擴(kuò)增出了BCV片段。測(cè)序顯示其核酸序列與BCV和人冠狀病毒都有很高的同源性，與人冠狀病毒4408株的序列同源性高達(dá)98%。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，且BCV在環(huán)境中存活時(shí)間較長(zhǎng)[9]，人鼻粘膜、皮膚、口腔黏膜以及頭發(fā)都有可能成為BCV的傳播載體[10]，在人工飼養(yǎng)的牛群和野生反芻動(dòng)物之間存在交叉感染[11]。因此，為保證牛源性生物制品的安全性，要加強(qiáng)牛源生物制品的質(zhì)量管理，建立的BCV FQ-PCR檢測(cè)方法為高通量高敏感性的BCV檢測(cè)提供了技術(shù)支持。