人正常肝細(xì)胞LO2感染HBV后表達(dá)CCL22

李 莉，李 剛，曹 紅，舒 欣，胡立立，關(guān) 瀛，羅雪艷

(1. 貴州省黔西南州人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，貴州 興義 562400； 2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染性疾病科， 廣州 510630；3.貴州省黔西南州人民醫(yī)院腫瘤科，貴州 興義 562400；4.貴州省黔西南州人民醫(yī)院，貴州 興義 562400)

全球有約3.5億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)，感染HBV后易發(fā)展為肝硬化、肝癌等疾病[1]。通常，HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制不會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，但機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)病毒抗原的免疫反應(yīng)會(huì)在清除病毒的同時(shí)損傷肝組織[2]。研究顯示，慢性乙型病毒性肝炎(chronic viral hepatitis B, CHB)患者的肝組織會(huì)浸潤大量Th17細(xì)胞，并且Th17細(xì)胞與CHB炎癥程度呈正相關(guān)[3]。CHB患者血清中趨化因子CC亞家族水平均比正常人增高，且隨著CHB患者病情的加重，血清中RANTES、MIF濃度逐漸升高，血清RANTES水平與ALT、AST和TBIL呈正相關(guān)，RANTES水平可反映肝臟炎癥活動(dòng)及損害情況，參與CHB發(fā)病[3]。但CHB肝組織浸潤Th17細(xì)胞的分子機(jī)制中尚不清楚。Yang等[4]發(fā)現(xiàn)由HBV誘導(dǎo)升高的TGF-β可抑制microRNA-34a的表達(dá)，導(dǎo)致趨化因子CCL22的產(chǎn)生增加。Kim等[5]發(fā)現(xiàn)IL-32基因在HT-29細(xì)胞中的誘導(dǎo)IL-8，TNF-α和CCL2表達(dá)。但HBV感染后，CCL22的產(chǎn)生是否依賴IL-32仍然未知。Xiang等[6]發(fā)現(xiàn)HBV的HBc蛋白能夠調(diào)控CREB的磷酸化并激活CREB通路。Poole等[7]發(fā)現(xiàn)人巨細(xì)胞病毒感染人成纖維細(xì)胞HFF細(xì)胞后CREB通路的激活會(huì)產(chǎn)生CCL22。基于此，本文旨在探討HBV感染人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞后表達(dá)趨化因子CCL22的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1購自北納生物公司(貨號(hào)：BNCC100496)；人正常肝細(xì)胞LO2購自湘雅細(xì)胞庫(HTCC編號(hào)：1)。HBV病毒獲贈(zèng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院及中國科學(xué)院武漢病毒所。

1.2 主要試劑與儀器

外源人類重組IL-32和TNF-α蛋白購自ABCAM公司(貨號(hào)：ab117198，ab9642)；小分子抑制劑Forskolin購自Selleck公司(貨號(hào)：S2449)； RPMI-1640培養(yǎng)基購自GE health公司(貨號(hào)：SH30091)；DMEDM培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司(貨號(hào)：11965)；胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司(貨號(hào)：10099-133)；CCL22、TNF-α和IL-32的ELISA試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司(貨號(hào)：BYE10457，BYE10038，BYE10123)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司(貨號(hào)：RR037A)； RT-qPCR試劑盒購自南京諾唯贊公司(貨號(hào)：Q711)。CREB抗體，p-CREB抗體和tubulin抗體購自CST公司(貨號(hào)：9197, 9198, 2146)。

Western blot裝置(Bio-Rad, 貨號(hào)：#1658004)；酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific, 貨號(hào)：51119700)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific, 貨號(hào)：51026331)；生物安全柜(Thermo Fisher Scientific, 貨號(hào)：51022485)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Trizol法抽取總RNA。利用核酸蛋白檢測儀測定樣品的OD230、OD260和OD280，OD260與OD280的比值在1.7至2.0之間，用1%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測提取的RNA質(zhì)量，5S、18S和28S的條帶清晰可見。用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用南京諾唯贊RT-qPCR試劑盒，在ABI的qPCR儀進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。使用Primer 5.0設(shè)計(jì)qPCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表1。將LO2細(xì)胞分為兩組，一組感染HBV，另一組不感染。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定IL-32的mRNA相對(duì)表達(dá)量(圖1上)；PCR結(jié)束后，進(jìn)行2%的瓊脂糖電泳(圖1下)。將THP-1細(xì)胞分為兩組，一組用外源人類重組IL-32蛋白刺激，一組不刺激。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量(圖3上)；PCR結(jié)束后，進(jìn)行2%的瓊脂糖電泳(圖3下)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理和病毒感染

THP-1維持在補(bǔ)充有2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中的潮濕氣氛(37℃，5% CO2)中，添加100 U/mL青霉素,100 μg/ mL鏈霉素和10%熱滅活的FBS。LO2細(xì)胞維持在補(bǔ)充有DMEM培養(yǎng)基中的潮濕氣氛(37℃，5%CO2)中，添加100 U/mL青霉素,100 μg/mL鏈霉素和10%熱滅活的FBS。IL-32終濃度為0.4 μg/mL；TNF-α終濃度分別為0、5、10、15 ng/mL。處理24 h后收細(xì)胞。LO2和THP-1細(xì)胞感染30MOI的HBV，感染后24 h的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 免疫印跡

進(jìn)行10%或12% SDS-PAGE的電泳，然后轉(zhuǎn)移到Immobilon-P PVDF膜(0.45 μm孔徑)。將PVDF膜在室溫下在含有0.01% Tween-20和5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水(10 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5, 150 mmol/L NaCl)中封閉1 h，然后在4℃下與目的蛋白的抗體溫育過夜。然后將膜在室溫下與綴合有HRP的相應(yīng)二抗孵育1 h。觀察特定蛋白質(zhì)使用ECL Plus Western印跡檢測系統(tǒng)

1.3.4 酶聯(lián)吸附試驗(yàn)

將包被緩沖液中的抗原(5～20 μg/ mL)加入到微量滴定板中。在37°C孵育4 h，然后在4°C下儲(chǔ)存直至使用。用洗滌液洗滌三次，在洗滌之間等待10 min。通過完全填充管或所有孔，用0.5%BSA封閉1 h。用洗滌液清洗4次，等待10 min。向每個(gè)孔中加入100 μL用PBS-TA稀釋的抗血清，在室溫下孵育5 h或在冰箱中孵育過夜。如前所述洗滌平板，然后加入用PBS-T稀釋的綴合物。在室溫下1.5 h或在37℃下1 h。洗滌4次，然后向每個(gè)孔中加入100 μL底物。加入100 μL 1 mol/L磷酸停止反應(yīng)。讀取450 nm數(shù)據(jù)。將LO2細(xì)胞分為兩組，一組感染HBV，另一組不感染。使用ELISA試驗(yàn)對(duì)LO2細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的IL-32進(jìn)行蛋白表達(dá)量的測定。將THP-1細(xì)胞分為兩組，一組用外源人類重組IL-32蛋白刺激，一組不刺激。使用ELISA試驗(yàn)對(duì)THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的TNF-α進(jìn)行蛋白表達(dá)量的測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HBV誘導(dǎo)LO2細(xì)胞表達(dá)IL-32

通過qPCR和ELISA發(fā)現(xiàn)感染了HBV的LO2細(xì)胞能夠表達(dá)和分泌IL-32。相對(duì)于不感染組，感染了HBV的LO2細(xì)胞能夠表達(dá)表達(dá)IL-32的mRNA，相應(yīng)的能夠檢測到LO2細(xì)胞上清中的IL-32分泌蛋白。基于此，HBV誘導(dǎo)LO2細(xì)胞表達(dá)IL-32。(圖1、圖2)

注： ***P<0.001。圖1 感染與未感染HBV的LO2細(xì)胞中IL-32 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Note. ***P<0.001.Figure 1 The relative expression of IL-32 mRNA in the HBV-infected and uninfected LO2 cells.

注： ***P<0.001。圖2 HBV感染與未感染的LO2細(xì)胞中IL-32 蛋白表達(dá)量的比較Note.***P<0.001.Figure 2 Comparison of the IL-32 protein levels in the HBV-infected and -uninfected LO2 cells

2.2 病毒誘導(dǎo)的IL-32誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α

發(fā)現(xiàn)用人IL-32刺激后的THP-1細(xì)胞能夠表達(dá)和分泌TNF-α。將THP-1細(xì)胞和LO2細(xì)胞共培養(yǎng)，TNF-α并沒有表達(dá)。用HBV感染THP-1細(xì)胞，TNF-α略微表達(dá)(圖3、圖4)。只有在THP-1細(xì)胞和LO2細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，再用HBV感染細(xì)胞，TNF-α才能表達(dá)(圖5)。基于此，病毒誘導(dǎo)的IL-32誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α。

注： ***P<0.001。圖3 IL-32感染與未感染的LO2細(xì)胞中TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量的比較Note. ***P<0.001.Figure 3 Relative mRNA expression of TNF-α in the IL-32-stimulated and unstimulated LO2 cells

注：IL-32刺激與不刺激時(shí)TNF-α 蛋白量的對(duì)比，***P<0.001。圖4 TNF-α的蛋白表達(dá)量Note. Comparison of TNF-α protein expression in the IL-32-stimulated and unstimulated LO2 cells，***P<0.001.Figure 4 Comparison of TNF-α protein expression in the IL-32-stimulated and unstimulated LO2 cells

注：TNF-α 蛋白量與control的對(duì)比， *P<0.05。圖5 病毒誘導(dǎo)的IL-32誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-αNote. The ratio of TNF-α protein in the treated cells to that of the control cells，*P<0.05.Figure 5 Virus-induced IL-32 in turn induces the secretion of TNF-α by THP-1 cells

圖6 外源刺激隨梯度增加的TNF-α?xí)rCREB和p-CREB的表達(dá)量Figure 6 Expression of CREB and p-CREB upon stimulation with increasing exogenous TNF-α

2.3 TNF-α誘導(dǎo)LO2細(xì)胞活化CREB通路

在LO2細(xì)胞中，外源刺激隨梯度增加的TNF-α，CREB的表達(dá)量并沒有明顯變化，而磷酸化的CREB的含量隨TNF-α濃度的升高而升高(圖6)。用imageJ軟件量化條帶后，可以明顯看到P-CREB的含量隨TNF-α濃度的升高而升高(圖7)。THP-1細(xì)胞和LO2細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，p-CREB的表達(dá)量與對(duì)照基本無區(qū)別。HBV感染THP-1細(xì)胞時(shí)，p-CREB的表達(dá)量也幾乎無區(qū)別。只有在THP-1細(xì)胞和LO2細(xì)胞共培養(yǎng)且HBV感染細(xì)胞時(shí)，p-CREB的表達(dá)量顯著增加(圖8)。基于此，TNF-α能誘導(dǎo)LO2細(xì)胞活化CREB通路，且THP-1細(xì)胞和LO2細(xì)胞共培養(yǎng)后用HBV感染能使p-CREB的表達(dá)量上升。基于此，TNF-α誘導(dǎo)LO2細(xì)胞活化CREB通路。

注：TNF-α梯度增加時(shí)p-CREB表達(dá)量與最低濃度TNF-α?xí)rp-CREB表達(dá)量對(duì)比，*P<0.05。圖7 LO2細(xì)胞中外源刺激隨梯度增加的TNF-α?xí)rCREB和p-CREB的表達(dá)量Note. Comparison of p-CREB expression at the lowest concentration of TNF-α with that under conditions of increased TNF-α concentration， *P<0.05.Figure 7 Expression of CREB and p-CREB in the LO2 cells upon stimulation with increasing exogenous TNF-α

圖8 不同條件下p-CREB的表達(dá)情況Figure 8 Expression of p-CREB under different conditions

2.4 CREB通路活化后促使LO2表達(dá)趨化因子CCL22

注：TNF-α刺激與否時(shí)CCL22 mRNA表達(dá)量比較，***P<0.001。圖9 TNF-α刺激與否時(shí)CCL22 mRNA表達(dá)量水平的比較Note. Comparison of CCL22 mRNA expression when TNF-α stimulation was applied or not，***P<0.001.Figure 9 Comparison of CCL22 mRNA expression when TNF-α stimulation was applied or not

注：TNF-α刺激與否時(shí)CCL22 蛋白表達(dá)量比較：***P<0.001。圖10 TNF-α刺激與否時(shí)CCL22 蛋白表達(dá)量水平的比較Note: Comparison of CCL22 protein expression levels when TNF-α stimulation was applied or not，***P<0.001.Figure 10 Comparison of CCL22 protein expression levels when TNF-α stimulation was applied or not

外源TNF-α刺激LO2細(xì)胞時(shí)，在mRNA水平上CCL22的表達(dá)量顯著增高(圖9)，且在蛋白水平上CCL22的表達(dá)量顯著增高(圖10)。THP-1和LO2細(xì)胞共培養(yǎng)且TNF-α刺激時(shí)，在蛋白水平上CCL22的表達(dá)量顯著增高(圖11)。THP-1和LO2細(xì)胞共培養(yǎng)且HBV感染時(shí)，在蛋白水平上CCL22的表達(dá)量顯著增高(圖11)。但是，這兩種CCL22表達(dá)量升高均能被小分子抑制劑Forskolin抑制(圖11)。為了排除趨化因子CCL22是THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的，用TNF-α刺激或感染HBV細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)CCL22蛋白水平的變化并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖12)。基于此，CREB通路活化后促使LO2表達(dá)趨化因子CCL22。

注：不同條件下CCL22的表達(dá)量與control對(duì)比,***P<0.001。圖11 不同條件下CCL22的蛋白表達(dá)量Note. CCL22 protein expressions under different conditions compared with that of the controls，***P<0.001.Figure 11 CCL22 protein expressions under different conditions compared with that of the controls

注：CCL22的表達(dá)量與control對(duì)比，P>0.05。圖12 THP-1細(xì)胞不同條件下CCL22表達(dá)量的對(duì)比Note. Compared with the control cells, P>0.05. Figure 12 Comparison of CCL22 expression in the THP-1 cells under different conditions

3 討論

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染影響全世界大約3.75億人[8]。目前其可以被抗病毒治療有效控制，但很少能夠完全清除慢性HBV感染[9]。此外，很大一部分慢性HBV感染患者不適合目前可用的抗病毒治療，并且仍然面臨肝硬化和肝細(xì)胞癌的高風(fēng)險(xiǎn)[8]。然而，對(duì)HBV感染的發(fā)病機(jī)制知之甚少是制定更有效治療策略的主要障礙[10]。HBV發(fā)病機(jī)制的核心假設(shè)在于認(rèn)為乙型肝炎是宿主特異性免疫介導(dǎo)的肝臟疾病[11]。大量的研究證實(shí)CD8+T細(xì)胞及非抗原特異性的淋巴細(xì)胞浸潤慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者的肝組織[2]。

Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)mDCs、pDCs在CHB患者的肝組織內(nèi)大量聚集，參與HBV感染后的肝損傷；且MIG、IP-10、IL-6等細(xì)胞因子在CHB肝組織中表達(dá)增高，并發(fā)現(xiàn)HBV的HBx蛋白通過活化NF-κβ誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)MIG[13]、IP-10[14]、IL-6[15]，MIG、IP-10可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞聚集肝臟，IL-6可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)肝內(nèi)急性期反應(yīng)蛋白的合成。而本研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染的LO2人肝細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)表達(dá)IL-32。IL-32調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝和免疫調(diào)節(jié)，是參與炎癥性疾病的病理調(diào)節(jié)劑或保護(hù)劑[16]。IL-32具有3種剪接變體IL-32α、IL-32β和 IL-32γ，其中IL-32γ在其N-末端具有疏水信號(hào)肽，這是分泌細(xì)胞因子的典型特征。基于此，推測HBV感染的LO2細(xì)胞后誘導(dǎo)產(chǎn)生并分泌的IL-32是IL-32γ。并且IL-32能夠誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α。TNF-α作為最重要的促炎細(xì)胞因子之一，通過誘導(dǎo)粘附分子的表達(dá)參與血管舒張和水腫的形成，以及白細(xì)胞與上皮細(xì)胞的粘附[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α水平降低后，CREB和pCREB的表達(dá)水平均明顯升高[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過外源TNF-α刺激LO2細(xì)胞，其胞內(nèi)CREB磷酸化水平明顯增高，CREB通路被激活。且活化后的CREB通路促使LO2表達(dá)了趨化因子CCL22。此外THP-1細(xì)胞和LO2細(xì)胞共培養(yǎng)后，再用HBV病毒感染，CREB通路同樣被活化，趨化因子CCL22同樣表達(dá)。但這兩種途徑致使的CCL22表達(dá)能被小分子抑制劑Forskolin阻斷。Forskolin是一種腺苷酸環(huán)化酶的激活劑，其增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。cAMP能夠誘導(dǎo)CREB在Ser133發(fā)生磷酸化，來募集CBP以激活轉(zhuǎn)錄[19]。而趨化因子CCL22在正常的肝組織中并不表達(dá)，但是Riezu-Boj等[20]研究發(fā)現(xiàn)慢性丙肝患者肝內(nèi)CCL17、CCL22表達(dá)增高，HCV可以誘導(dǎo)CCL17、CCL22表達(dá)，增高的CCL17、CCL22誘導(dǎo)Treg聚集于肝組織。基于此，研究人員推測HBV感染宿主肝細(xì)胞后，誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IL-32，之后作為分泌蛋白的IL-32刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)分泌蛋白TNF-α，然后TNF-α又刺激肝細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCL22。之后，CCL22/CCR4介導(dǎo)Treg細(xì)胞浸潤至慢性肝炎患者的肝組織。而肝內(nèi)Treg細(xì)胞高表達(dá)CXCR3、CCR4等趨化因子[21]，介導(dǎo)Th17細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤至慢性肝炎患者的肝組織。最后，肝內(nèi)聚集的免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子導(dǎo)致CHB患者肝損傷。

綜上所述，IL-32誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌的TNF-α促進(jìn)HBV感染的LO2細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCL22。