逆遺傳方向研究男性G6PD缺乏癥及其母親的表型與基因型

李磊 郭洪創 肖奇志 李戀湘

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phodphate dehydrogenase，G6PD)缺乏癥是人類最常見紅細胞酶缺陷病之一，全球約有4億人受累[1]。在我國長江以南地區也較為多見，G6PD基因突變攜帶率介于4%～10%。G6PD缺乏癥為X連鎖不完全顯性遺傳病，主要累及男性個體，男性半合子G6PD酶活性缺乏顯著；對于女性純合子、雙重雜合子或單個突變攜帶者也可發病[2]；女性雜合子酶活性有較大的變異度，其表型從嚴重缺乏、中度缺乏、輕度缺乏到完全正常均有分布，這種酶活性分布的復雜性導致女性G6PD篩查時檢出率低，不管采用目前的熒光斑點試驗進行G6PD篩查還是硝基四氮唑藍法(nitroblue tetrazoliun test, NBT)檢測G6PD酶活性，均會出現不同程度的女性G6PD攜帶者的篩查漏檢率。各實驗室結果差異巨大，結果從22.7%～58.7%[3]。另外相同的G6PD基因突變對于男性和女性酶活性影響的差異性也缺乏準確結論。由目前的篩查方法入手難以得出真實女性基因攜帶率，也難以準確研究表型與基因型的關系。為此本文改變從女性篩查到子代的常規思路，由確診為G6PD缺乏的男性子代開始，逆遺傳方向研究母親G6PD表型與基因型。

對象與方法

一、對象

珠海市婦幼保健院門診從2015—2017年收集確診為G6PD酶活性缺乏者男性子代(熒光斑點定性試驗和G6PD酶活性定量測定)124例，再收集其母親標本，男性子代年齡段為1個月～11歲，母親年齡段為21～42歲。并隨機收集40例G6PD熒光斑點試驗正常的男性和其母親血液樣本作為對照。本研究通過珠海市婦幼保健院醫院倫理委員會批準。

二、方法

1.G6PD酶活性測定：采集所有受試者EDTA-K3抗凝外周血2 ml置于4℃冰箱內24小時內檢測，采用熒光斑點試驗和硝基四氮唑藍法分別進行G6PD定性篩查和定量測定。熒光斑點法的血片孵育溫度為37℃，底物終濃度為0.78 mmol/L G6PNa2和0.195 mmol/L NADP+，作用時間為10 min[4]，10 min內出現強熒光(灰綠色)為正常，熒光稍弱判斷為輕度缺乏，明顯減弱判斷為中度缺乏，無熒光且20 min后仍無熒光判斷為重度缺乏。硝基四氮唑藍法結果參考值范圍：G6PD/6PGD在1.1～2.5之間為正常參考范圍，G6PD/6PGD<1.1則為G6PD缺乏。

2.G6PD基因型檢測：上述標本均采用廈門致善生物科技有限公司Lab-aid820磁珠法抽提人類白細胞基因組DNA，DNA緩沖液(Tris-EDTA buffer solution)TE溶解，采用紫外分光儀測定其純度與濃度，以保證所抽提的DNA質量符合要求，在使用時稀釋至20 μg/μl。采用熒光PCR熔解曲線法(PMCA)[5]檢測常見16種G6PD基因突變，采用配套試劑盒, 嚴格按照所提供的使用說明書操作。在美國Bio-Rad公司生產的 CFX96 擴增儀上進行擴增和檢測。

結 果

一、男性后代G6PD缺乏者酶活性分布

受檢男性后代G6PD熒光斑點法篩查均呈現缺乏，NBT法G6PD酶活性平均值2.66 U/gHb(95% CI:1.1～8.58 U/ gHb)，G6PD/6PGD比值平均值為0.26(95% CI:0.1～0.75)，G6PD酶活性和比值均呈現顯著下降，受檢者G6PD酶活性分布集中在1～4 U/gHb，大于5 U/gHb僅有5例，所有測定值均小于8 U/gHb(見圖1)。

圖1 男性子代G6PD缺乏者酶活性分布圖Figure 1 Distribution of enzyme activity in male offspring with G6PD deficiency

二、女性G6PD基因突變攜帶者酶活性分布

受檢母親G6PD酶活性平均值15.83 U/gHb(95% CI:1.44-31.2 U/gHb)，G6PD/6PGD比值平均值為1.32(95% CI:0.12-2.25)，從分布情況看，除酶活性小于3 U/gHb段(均有雙重基因突變)的標本數量多以外，其余以均值為中心，近似于對稱分布(見圖2)，其范圍也涵蓋了正常女性G6PD酶活性的全部區間(95% CI:15.86-30.57 U/gHb)。其中被檢母親G6PD酶活性大于13.1 U/gHb(按NBT法判定為酶活性正常)占70.2%(87/124)，而酶活性小于13.1 U/gHb占29.9%，所以按NBT法篩查G6PD基因突變攜帶母親漏檢率達到70.1%。按熒光斑點試驗判斷，母親漏檢率更高達74.2%(92/124)。

三、相同的G6PD基因突變對于男性和女性G6PD(排除雙重突變)酶活性的影響

由于女性和男性在X染色體數量上的差異，攜帶相同的基因突變對于男性與女性影響不同，男性G6PD突變半合子酶活性顯著下降至正常的11.8%(2.66/22.50)；攜帶相同突變基因的女性，平均酶活性尚處于正常范圍，酶活性輕微下降為正常對照組的80.0%(17.99/22.50)。而攜帶相同突變基因的男性G6PD酶活性僅相當于其母親的14.8%(2.66/17.99)，各種不同基因突變類型在男性相對女性G6PD酶活性影響上，1 388(G>A)、1 376(G>T)、95(A>G)、871(G>A)這四種常見突變影響均相近，而1 024(C>T)突變對于男性的影響稍小，各種基因型間的差異不明顯。見表1。

圖2 女性母親G6PD缺乏者酶活性分布圖Figure 2 Distribution of enzyme activity in mothers with G6PD deficiency

四、男性子代G6PD突變者與雙重突變母親的表型與基因型比較

男性G6PD缺乏者其母親也出現嚴重G6PD缺乏(酶活性小于5 U/gHb)的樣本，在所有研究樣本中19例雙重突變母親中共有16例母親G6PD酶活性小于5 U/gHb，平均值為3.28 U/gHb，其男性子代酶活性均小于5 U/gHb，平均值為2.63 U/gHb，19例母親標本中18例檢測出G6PD基因突變雙重雜合子或純合子，另有1例標本中母親僅檢測到95(A>G)突變，但其存在G6PD缺乏表型的子代突變也未檢出，推測母親應該為雙重雜合子。還有3例雙重雜合突變標本酶活性大于5 U/gHb(95% CI:5.19-6.87 U/gHb)，也接近判斷值5 U/gHb，可能與酶測定操作有關或雙重雜合子本身存在一定變異。從各種基因突變的組合看，未發現雙重雜合子的不同基因型與酶活性有相關性。見表2。

討 論

G6PD基因突變女性雜合子的酶活性主要由G6PD基因引起，即便是同種突變的女性雜合子也表現出不同的酶活性，從G6PD酶正常到酶顯著缺乏均有發生。女性攜帶單一突變基因，酶活性呈連續性大跨度分布，表型篩查檢出率低；男性酶活性僅約為攜帶相同基因突變的女性的1/6。女性攜帶雙重突變者嚴重影響G6PD酶活性，與男性半合子相當。因此從男性后代G6PD缺乏者入手，與其母親進行配對研究，可有效得出女性基因攜帶率。

逆遺傳方向研究女性G6PD表型與基因型，其優勢：一是男性子代G6PD缺乏者無論是篩查、酶活性測定和基因診斷，結果明確，反推其母親必定攜帶G6PD基因突變；二是男性G6PD缺乏者在人群中的分布是隨機的，從而其母親的選擇也是隨機的，防止從女性 G6PD缺乏者選擇開始導致結論出現偏差；三是可以從男性后代基因型推測母親基因型或可能的基因型，防止漏檢。在G6PD篩查熒光斑點試驗與NBT法酶活性測定過程中，在男性中兩種結果的吻合度為100%，男性子代G6PD酶活性平均值2.66 U/gHb，G6PD/6PGD比值平均值為0.26，與正常男性對照結果差異明顯，不管是G6PD酶活性篩查、酶活性測定和基因檢測，均能確診。需要注意的是男性如果處于急性溶血狀態，其G6PD酶活性會應激性增高，可能導致基因型與表型結果不符[6]。男性和女性在G6PD篩查與酶活性測定時診斷效率差異明顯，而這種差異性在臨床咨詢時需注意[7]。

表1 不同基因突變類型對于男性與女性影響程度比較Table 1 Comparison of the effect of different gene mutation types on male and female

表2 男性子代G6PD突變者與雙重突變母親的表型與基因型比較Table 2 Comparison of phenotype and genotype between male offspring with G6PD mutation and double mutation mothers

Note：*The G6PD activity in male offspring was decreased but no mutation was detected. It was presumed that the mutation was unknown. The mother only detected 95(A>G) mutation, which was supposed to be a double heterozygous mutation according to the phenotype.

在研究樣本中19例雙重突變母親中共有16例母親G6PD酶活性小于5 U/gHb(屬于嚴重缺乏)，3例雙重雜合突變標本酶活性分別為5.19 U/gHb、6.54 U/gHb、6.87 U/gHb(判斷為中度缺乏)，總體平均值僅為3.28 U/gHb，而其子代酶活性平均值為2.63 U/gHb，兩者G6PD酶活性相當。酶活性測定中兒子低于母親樣本占79.0%(15/19)，說明G6PD基因突變無論如何改變都是對男性的影響甚于女性。另在樣本8中其子代具有G6PD缺乏表型，而突變基因類型尚未檢出，母親僅檢測到95(A>G)突變，故依據表型推測母親也為雙重雜合子。

對于女性的G6PD表型多樣性，多采用Lyon假說的X染色體隨機失活進行解釋[8]，后來許多學者又對Lyon假說進行過補充，但是在臨床上所見的女性的G6PD表型還是具有遺傳異質性，攜帶單一突變基因者酶活性從5.0～31.2 U/gHb，中位數為17.99 U/gHb，與正常女性中位數22.50 U/gHb相比，總體酶活性呈現輕微下降，這可能不僅僅是隨機失活的效應，也與女性雜合子G6PD基因啟動子區CpG島特異性甲基化和野生型等位基因優先失活有關，而且野生型等位基因失活與G6PD/6PGD呈負相關，所以G6PD啟動子中CpG島位點具有高特異性甲基化和野生型等位基因優先X染色體失活的雜合子是酶活性缺乏的高危因子[9]。

采用分子診斷方法篩查女性G6PD基因攜帶者代替大比例漏檢風險的表型篩查方法技術上已經成熟[10-12]，對于妊娠或準備孕育的婦女，準確的基因篩查結果有利生育后的及時處理[13]。對于攜帶相同基因類型的母子，酶活性相差甚多。另外對于女性的表型與基因型復雜關系，在臨床咨詢中必須予以高度重視。