山蒼子蛋白堿提工藝優化及其功能性質研究

張 園，仇超穎，汪 勇，何佳靜，張 震

(1.暨南大學 食品科學與工程系，廣東高校油脂生物煉制工程技術研究中心，廣州 510632；2.暨南大學-薩斯喀切溫大學 “油料生物煉制與營養”聯合實驗室，廣州 510632；3.清遠市瑤康生物科技有限公司，廣東 清遠 513200)

山蒼子(Litseacubeba)又名山雞椒、山姜子，是樟科(Lauraceae)木姜子屬落葉灌木。山蒼子在我國分布非常廣泛，在廣東、廣西、湖南等省廣泛種植，盛產期高達15 000～22 500 kg/hm2，是一類重要的山區資源。山蒼子根、莖、葉和果實均含有芳香油，均可入藥，山蒼子油中含檸檬醛、檸檬醇、有機酸等[1-2]。同時，山蒼子油具有抗菌[3]、抗氧化[4]、驅避昆蟲[5]和抗腫瘤[6]等多種生物活性。提取山蒼子精油后的核仁中含有40%左右的核仁油，其脂肪酸組成與椰子油相似，可廣泛用于制造食品級、化妝品級表面活性劑。將提取精油后的山蒼子果渣混在飼料中，能夠提高豬瘦肉率，有試驗表明，6%的山蒼子果渣餅粉對飼料的防霉效果與0.3%的丙酸相當，防霉性能明顯優于辣椒粉和桔皮粉，說明山蒼子果渣不僅可以直接作為飼料原料，而且還兼有飼料天然防腐劑的功能[7]。山蒼子除含極其豐富的油脂外，還含有20%～30%的優質蛋白質。

我國目前對山蒼子的研究多偏重于芳香油及核仁油方面，隨著山蒼子種植及加工業的不斷擴大，產生大量山蒼子廢棄粕，如何對粕中蛋白質利用成為一個亟待解決的問題。目前對山蒼子綜合利用的研究報道相對較少。堿溶酸沉法是一種經典的蛋白提取方式，尤其在種子、果實等作物的蛋白提取中應用廣泛[8]。為了更好地對山蒼子資源綜合利用，提高其附加值，本文利用堿溶酸沉法對提取精油及核仁油后的山蒼子粕中蛋白質進行研究，確定提取工藝參數，并測定山蒼子蛋白的起泡性、乳化能力、持水能力等功能性質，以期為山蒼子蛋白的深入開發提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

山蒼子，由清遠市瑤康生物科技有限公司種植基地提供；大豆食用油，市售；大豆分離蛋白，來自麥克林生化科技有限公司。氫氧化鈉、鹽酸、正己烷等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

KDC-1044低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；可調高速均質器，金壇市晶玻實驗儀器廠；722s可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；pHS-3C精密pH計，上海精密科學儀器有限公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；自動凱氏定氮儀，湖北正金儀器設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫脂山蒼子粕制備

將山蒼子脫除果肉后粉碎過60目篩，用料液比1∶10(質量體積比)的正己烷在功率為20%、室溫25℃ 條件下超聲浸提5 min，真空抽濾分離，將濾渣放置通風櫥充分揮發至無正己烷殘留。

1.2.2 常規指標檢測

水分測定參照GB 5009.3—2016；粗蛋白質測定參照GB/T 14489.2—2008；粗脂肪測定參照NY/T 4—1982；灰分測定參照GB 5009.4—2016；粗纖維及其他物質含量：100%-(水分含量+粗蛋白質含量+粗脂肪含量+灰分含量)。

1.2.3 山蒼子蛋白等電點測定

稱取5 g脫脂山蒼子粕，在浸提pH 10、浸提溫度25℃、料液比1∶10條件下浸提60 min，3 500 r/min 離心20 min得到上清液，之后用1 mol/L HCl調溶液pH至4.0，離心得到沉淀，冷凍干燥得山蒼子粗蛋白。相同條件下進行多次提取，合并提取的蛋白。稱取1.000 0 g粗蛋白，加入100 mL10 mmol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，分別調節pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、9.0，充分攪拌2 h，離心20 min(3 500 r/min)。取上清液，采用福林酚法在500 nm波長下測定吸光度，以牛血清白蛋白標準曲線計算上清液中蛋白質含量[9]。

1.2.4 山蒼子蛋白提取工藝

將脫脂山蒼子粕用NaOH溶液在一定溫度下浸提一定時間，3 500 r/min離心20 min得到上清液，之后用1 mol/L HCl調溶液pH至山蒼子蛋白等電點，離心得到沉淀，冷凍干燥即得山蒼子粗蛋白。山蒼子蛋白提取率根據如下公式計算。

提取率=山蒼子粗蛋白質量×粗蛋白中蛋白質含量/(山蒼子粕質量×粕中蛋白質含量)×100%

1.2 5 起泡性及泡沫穩定性測定[10]

稱取山蒼子粗蛋白0.400 g，溶解于20 mL蒸餾水中，測定此時溶液體積V0，分別調其pH為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，室溫條件下磁力攪拌1 h，之后將溶液置于均質機10 000 r/min剪切2 min，測定此時泡沫體積V1，并記錄均質停止靜置30 min后泡沫體積V2。起泡性和泡沫穩定性計算公式如下。

起泡性=V1/V0×100%

泡沫穩定性=V2/V0×100%

1.2.6 乳化性測定[11]

稱取0.400 g山蒼子粗蛋白溶于20 mL蒸餾水中，分別調其pH為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，室溫磁力攪拌1 h，分別加入20 mL大豆油，在均質機中以10 000 r/min攪打2 min，轉入50 mL離心管， 3 500 r/min離心20 min。根據乳化層高度(H1)和溶液總高度(H2)計算乳化性，計算方法如下。

乳化性=H1/H2×100%

1.2.7 持水性測定[10,12]

取50 mL塑料離心管，稱重為M1。分別稱取0.400 g山蒼子粗蛋白，置于離心管中，加入蒸餾水20 mL，調節pH分別至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，恒溫振蕩60 min。另將裝有山蒼子粗蛋白的離心管分別置于水浴鍋中30、45、60、75、90℃保溫30 min后在冷水中冷卻30 min。之后3 500 r/min離心20 min，傾倒去除上清液，稱取離心管的質量M2。分別計算pH和溫度對蛋白質持水力的影響。蛋白持水力計算公式如下。

持水力=(M2-M1-0.4)/0.4

1.2.8 數據分析

數據均為3組測定結果的平均值，采用Origin 8.0進行數據整理、分析及作圖，利用SPSS 17.0對結果進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 脫脂山蒼子粕主要成分(見表1)

表1 脫脂山蒼子粕主要成分 %

由表1可知，脫脂山蒼子粕中粗蛋白質含量為37.30%，此外含有大量的粗纖維成分，主要是山蒼子核殼部分，同時含有10.80%的水分、4.07%的粗脂肪及2.71%的灰分。山蒼子粕中粗蛋白質含量較高，可將其作為一種新型蛋白質資源加以開發利用。

2.2 山蒼子蛋白等電點

不同pH下的山蒼子蛋白溶解度如圖1所示。

圖1 不同pH下山蒼子蛋白溶解度

由圖1可以看出，當pH在3～5范圍內時，山蒼子蛋白溶解度較低，最低值在pH 4.0左右，此時上清液中山蒼子蛋白溶解度僅為0.086 mg/mL，當pH大于6.0時，山蒼子蛋白溶解度顯著增加，pH 7～8時，山蒼子蛋白溶解度為0.25 mg/mL左右，當pH為9時，山蒼子蛋白溶解度增加至0.35 mg/mL。等電點時蛋白分子帶電荷最少，因此靜電斥力最小，蛋白聚集使溶解度最低，并形成沉淀[13]，故后續選取等電點4.0為山蒼子蛋白提取時的酸沉pH。山蒼子蛋白等電點與花生蛋白及其他大多數油料蛋白的等電點較為相似[14-15]。

2.3 山蒼子蛋白提取單因素試驗

2.3.1 浸提pH對山蒼子蛋白提取率的影響

在浸提溫度35℃、料液比1∶15和浸提時間60 min條件下，研究浸提pH對山蒼子蛋白提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 浸提pH對山蒼子蛋白提取率的影響

從圖2可以看出，隨著浸提pH的提高，山蒼子蛋白提取率不斷升高。山蒼子蛋白組分多數為堿溶蛋白，隨浸提pH增大蛋白帶電荷增多，溶出能力提高，當浸提pH升高到11以后，繼續增大浸提pH，山蒼子蛋白提取率增大幅度變緩，表明在浸提pH為11時山蒼子蛋白能夠溶出較多。強堿性條件下，蛋白質的營養學特性易改變，易導致脫氨、脫羧和肽鍵斷裂等化學反應，生成賴氨酰丙氨酸等有毒物質，造成營養物質損失[16]；除此之外，強堿條件還會使蛋白質變性和水解，產生黑褐色物質，影響產品色澤和風味[17-18]。考慮到過高濃度的堿液會引入大量的離子，增加產品的鹽分[19]，故浸提pH選擇11為佳。

2.3.2 料液比對山蒼子蛋白提取率的影響

在浸提時間60 min、浸提溫度35℃、浸提pH 11條件下，研究料液比對山蒼子蛋白提取率的影響，結果如圖3所示。

圖3 料液比對山蒼子蛋白提取率的影響

由圖3可以看出，山蒼子蛋白提取率隨料液比的增加而升高，當料液比為1∶15時，山蒼子蛋白提取率最大，當料液比為1∶5時提取率相對較低。這是因為當料液比較低時，山蒼子粕膳食纖維吸水膨脹，不易攪動，降低了提取效率[20]。料液比升高至1∶20 時提取率無增長趨勢。此時浸提液較多，降低了蛋白質分子在水中的擴散作用，導致蛋白溶出下降，同時提取液中蛋白質濃度偏低，也不利于蛋白提取后的酸沉過程[21]。綜合考慮，料液比選擇1∶15為佳。

2.3.3 浸提時間對山蒼子蛋白提取率的影響

在料液比1∶15、浸提溫度35℃、浸提pH 11條件下，研究浸提時間對山蒼子蛋白提取率的影響，結果如圖4所示。

圖4 浸提時間對山蒼子蛋白提取率的影響

由圖4可以看出，延長浸提時間，山蒼子蛋白提取率會略微提高，但過長的浸提時間并不能有效提高提取率，蛋白質在60 min提取過程已接近完全溶出。由于浸提時間越長，能耗越大[22]，故浸提時間選擇60 min為佳。

2.3.4 浸提溫度對山蒼子蛋白提取率的影響

在料液比1∶15、浸提pH 11、浸提時間60 min條件下，研究浸提溫度對山蒼子蛋白提取率的影響，結果如圖5所示。

圖5 浸提溫度對山蒼子蛋白提取率的影響

由圖5可以看出，當浸提溫度為25℃時，山蒼子蛋白提取率為30.09%，當浸提溫度升高至35℃時，提取率略微升高，浸提溫度繼續升高，提取率變化不大，由于浸提溫度過高會使蛋白質變性并增加能源消耗，同時會對蛋白結構造成一定影響[23]。綜合考慮，浸提溫度選擇35℃為佳。

2.4 正交試驗優化山蒼子蛋白提取工藝條件

根據單因素試驗結果，以浸提pH、浸提溫度、料液比、浸提時間4個因素為變量，山蒼子蛋白提取率為指標，進行L9(34)正交試驗，以確定堿提山蒼子蛋白最佳工藝條件。正交試驗因素水平見表2，正交試驗設計及結果見表3。

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗設計及結果

由表3可以看出，在堿提山蒼子蛋白工藝中，4個因素主次順序為浸提pH>浸提溫度>料液比>浸提時間，最優組合為A3B2C2D1，即浸提pH 12、浸提溫度35℃、料液比1∶15、浸提時間60 min。但由于當浸提pH為12時，溶液處于過堿狀態，蛋白質的性質和結構將易被破壞，故浸提pH選取11，在此條件下提取率為31.03%，提取物中蛋白質含量為75%。

2.5 pH對山蒼子蛋白起泡性及泡沫穩定性的影響(見圖6)

圖6 pH對山蒼子蛋白起泡性及泡沫穩定性的影響

由圖6可見，pH對山蒼子蛋白起泡性具有顯著影響，起泡性整體變化趨勢與山蒼子蛋白溶解度呈現相似趨勢。在等電點pH 4附近，山蒼子蛋白溶解度最低，起泡性也最低，約為5%，隨著pH偏離等電點，山蒼子蛋白可溶部分增多，起泡性顯著升高，當pH為10時，起泡性達130%。泡沫穩定性呈現相似趨勢，隨著pH偏離等電點，山蒼子蛋白溶解度的增加，使更多的蛋白質作為泡沫穩定劑吸附在氣泡表面，蛋白質分子間相互作用形成較厚的吸附膜，從而增加泡沫穩定性[24]。雖然山蒼子蛋白在pH 10時具有最高的起泡性，但此時泡沫穩定性并未顯著提升，表明高堿性pH時蛋白結構伸展，使得蛋白吸附速度提高，但同時由于此時靜電斥力增大，故起泡性增大，但泡沫穩定能力下降。

2.6 pH對山蒼子蛋白乳化性的影響(見圖7)

圖7 pH對山蒼子蛋白乳化性的影響

由圖7可見，當pH為4時，山蒼子蛋白的乳化性最低，可能是由于等電點時溶解性較差，吸附在油-水界面上的蛋白數量減少，蛋白呈現聚集狀態，導致表面活性較低。中性及堿性條件時，蛋白分子靜電斥力增大，蛋白表面帶電荷量增多，有利于避免蛋白的聚集，此時蛋白溶解度較高，較多蛋白分子吸附在兩相界面上，使得乳化性提高[25]。

2.7 持水性

2.7.1 pH對山蒼子蛋白持水性的影響(見圖8)

圖8 pH對山蒼子蛋白持水性的影響

持水性可表征蛋白與水分子結合形成凝膠的能力。由圖8可見，山蒼子蛋白的持水力在pH 2～10范圍呈現先下降后上升的趨勢，在pH 4～6范圍山蒼子蛋白的持水力較低，在偏酸性和偏堿性條件下具有較高的持水力。這可能是因為pH影響了蛋白分子的離子作用和靜電荷數量，從而影響蛋白分子間的作用力以及蛋白與水分子結合的能力。遠離等電點時，蛋白分子靜電斥力增加，使持水性增加[26]。

2.7.2 溫度對山蒼子蛋白持水性的影響(見圖9)

圖9 溫度對山蒼子蛋白持水性的影響

由圖9可見，山蒼子蛋白的持水力隨著溫度的升高呈現先升高后下降的趨勢。在30～60℃，山蒼子蛋白的持水力隨著溫度的升高而增大，60℃時達到最大；超過60℃，隨著溫度繼續升高，持水力略有下降，這可能與蛋白質的熱變性有關，高溫時蛋白分子構象發生變化，分子之間相互聚集，從而使持水力下降。蛋白質適度的熱變性有利于其分子的伸展，從而增加蛋白質分子與水作用程度，而過高的溫度會使蛋白質熱變性程度升高[27]。同時將山蒼子蛋白持水力與商業大豆分離蛋白的持水力比較，可發現山蒼子蛋白持水力與大豆分離蛋白接近，并在溫度低于60℃時持水力略高于大豆分離蛋白。

3 結 論

對山蒼子核仁中蛋白提取工藝條件進行單因素試驗和正交試驗，得到的最佳工藝條件為：浸提pH 11，料液比1∶15，浸提溫度35℃，浸提時間60 min。在最佳條件下，山蒼子蛋白的提取率為31.03%，提取物中蛋白質含量為75%。山蒼子蛋白等電點為4.0，山蒼子蛋白的起泡性、乳化能力、持水能力均在pH偏堿性范圍較高，在等電點附近，山蒼子蛋白溶解性、乳化性及起泡性均較低。山蒼子蛋白持水性與商業大豆分離蛋白接近，具有較好的功能性質。