黑果腺肋花楸原花青素分離純化工藝研究

滕 飛，李 麗，皮子鳳

(1.長春師范大學，吉林長春 130032；2.中國科學院長春應用化學研究所，吉林長春 130022)

黑果腺肋花楸(AroniamelanocarpaElliot)是薔薇科，腺肋花楸屬灌木，原產于北美東北部，是美國特有的一種集食用、生態多種功能于一身的珍貴樹種。果實單寧含量較高，使其口感略微酸澀，球形，且果皮紫黑，果肉暗紅[1]。黑果腺肋花楸果實具有非常突出的保健作用，果實及其提取物對心臟病、高血壓等心腦血管疾病具有特殊的療效，在歐美地區廣泛應用于醫藥和功能食品工業。1990年，我國從朝鮮引進一個品種，至今我國已擁有了該樹種較為豐富的種質資源基礎。國內外研究結果表明，黑果腺肋花楸果實中富含黃酮、原花青素等多酚類成分，且多酚類成分是目前已知植物中含量最高的[2]，每100 g果子中大約含有2500 mg的多酚類化合物，而其中又以原花青素類物質的含量最高。研究表明，原花青素具有很強的抗氧化能力，對降血壓、降血糖[3]以及治療心血管疾病都有很大的幫助。

大孔樹脂吸附純化法是目前使用最廣泛的一種純化方法，常用于藥物以及功能性成分的純化[4]。本文擬采用大孔樹脂吸附純化法對黑果腺肋花楸果實中的原花青素進行分離純化。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

PHS-2C型數字顯示酸度計(上海光學儀器廠)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；分析天平(上海越平科學儀器有限公司)；JJ-2勻漿組織搗碎機；KS-5000P離心機(北京東迅天地醫療儀器公司)；R100旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)；SpectraMax i3酶標儀；SHB-B88型循環水式多用真空泵；層析柱(1.8 cm×30 cm)。

1.2 材料與試劑

黑果腺肋花楸凍果(鮮果洗凈瀝干放于-20℃冷凍，沈陽睿洋農業有限公司)；原花青素標準品(上海融禾醫藥科技有限公司，生產批號：180326)；正丁醇、鹽酸、乙醇、甲醇均為分析純(北京化工廠)；硫酸高鐵銨溶液(NH4Fe(SO4)2·12H2O)(上海麥克林生化科技有限公司，用濃度為2 mol·L-1的鹽酸配置成2%(w/v)的溶液)；DM130型大孔樹脂、X-5型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂、D101型大孔樹脂、NKA-9型大孔樹脂(艾美科健(中國)生物醫藥有限公司)。

1.3 原花青素含量的測定方法

稱取原花青素標準品10 mg溶于10 mL甲醇中，吸取該溶液0、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后，取出6 mL置于具塞錐瓶中，再加入0.2 mL硫酸高鐵銨溶液和1 mL上述原花青素溶液，混勻，置沸水浴回流，精確加熱40 min后，立即置冰水中冷卻，在加熱完畢15 min后，于546 nm波長處測吸光度[5]。

1.4 黑果腺肋花楸原花青素提取條件優化

根據戰偉偉等[6]研究的多種提取劑對原花青素提取的影響結果，本文擬采用正交實驗考察不同濃度乙醇、料液比、提取時間和提取溶液pH對原花青素提取率的影響，確定最佳提取工藝。正交實驗因素表見表1。

表1 正交實驗因素表

1.5 黑果腺肋花楸原花青素分離純化工藝研究

1.5.1 大孔樹脂的預處理

將AB-8、D101、DM130、NKA-9、X-5五種大孔樹脂分別置于無水乙醇中進行活化，不斷攪拌除去氣泡，浸泡24 h，使其充分溶脹。用蒸餾水沖洗至無醇味[7]。

1.5.2 大孔樹脂的篩選

稱取一定量的果漿，采用最佳提取方法超聲提取，離心取上清液，使用旋轉蒸發儀于60℃條件下減壓濃縮除去乙醇。加水稀釋后離心取上清液，沉淀物加水溶解再次離心，合并上清液。測定溶液中原花青素的濃度。

分別稱取預處理好的5種大孔樹脂各5 g，放于100 mL錐形瓶中，加入50 mL一定質量濃度的黑果腺肋花楸原花青素粗提液，于震蕩器中震蕩吸附24 h。取上清液測定溶液中原花青素含量，并按公式(1)、公式(2)計算吸附量及吸附率。

使用蒸餾水清洗吸附后的大孔樹脂，至表面無黑果腺肋花楸原花青素粗提液殘留后，加入50 mL 70%乙醇溶液。放入振蕩器中靜態解吸24 h[8-9]，取上清液測定原花青素含量，并按公式(3)計算解吸率[10]。

(1)

(2)

(3)

其中,Q為吸附量(mg·g-1)；C0為起始質量濃度(mg·mL-1)；C1為平衡質量濃度(mg·mL-1)；V1為吸附溶液體積(mL)；m為樹脂質量(g)；C為解吸后溶液中原花青素質量濃度(mg·mL-1)；V為解吸溶液體積(mL)。

1.5.3 大孔樹脂動態吸附—解吸條件優化

(1)將預處理后的大孔樹脂裝柱，測定柱體積(BV)和樹脂裝量。

(2)按照確定的最佳提取工藝提取黑果腺肋花楸，將提取液濃縮至無醇味后上柱，分別將流速控制在0.5 mL·min-1、1 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2 mL·min-1、3 mL·min-1，以1BV為單位收集流出液，確定流出液中原花青素濃度，以流出體積為橫坐標，原花青素的濃度為縱坐標繪制曲線。以流出液中原花青素的濃度達到上樣濃度的1/10為泄漏點，當吸附的過程中達到了樹脂的泄漏點時，樹脂的吸附達到飽和，此時樹脂的吸附量達到最大值。

(3)確定最佳上樣流速后，分別將不同濃度的提取液上樣，收集流出液，測定流出液中的原花青素含量。以流出體積為橫坐標、原花青素的濃度為縱坐標繪制流出曲線。以流出液中原花青素的濃度達到上樣濃度的1/10(泄漏點)，停止收集，合并流出液，測定流出液中的原花青素含量，從而計算不同濃度下的吸附率，找到最佳上樣濃度和上樣量。

(4)確定好最佳濃度、最佳上樣流速、上樣量后，按照該條件上樣。上樣后靜止2 h，用4 BV水沖洗，然后分別以不同濃度(乙醇洗脫)，每個濃度洗脫4 BV，合并各濃度洗脫液，分別測定洗脫液中原花青素含量[11]。

2 結果與討論

2.1 原花青素含量測定標準曲線

標準曲線回歸方程為Y=2.4505X+0.0418，R2=0.9918，在0～0.3 mg·mL-1范圍內具有良好的線性。標準曲線如圖1所示。

圖1 原花青素含量測定標準曲線

2.2. 黑果腺肋花楸原花青素提取條件優化

條件優化正交實驗結果和方差分析如表2、表3所示。從直觀分析及方差分析上述實驗結果表明,各項因素對工藝影響為：提取時間>料液比>乙醇濃度>pH。4個因素中提取時間對黑果腺肋花楸原花青素的提取率的影響較為明顯。因此從正交表優選的工藝為A2B2C2D1。按照A2B2C2D1的條件進行驗證實驗，測定提取液的原花青素含量為0.988 mg·mL-1，與正交實驗結果相一致。因此，確定黑果腺肋花楸提取條件為pH=3的70%乙醇，料液比1∶15，超聲提取30 min。

表2 黑果腺肋花楸原花青素提取工藝正交試驗結果表

表3 正交實驗方差分析結果

2.3 黑果腺肋花楸原花青素分離純化工藝研究

2.3.1 大孔樹脂的優選

通過1.5.2方法對大孔樹脂吸附黑果腺肋花楸原花青素吸附能力進行測定，得到各樹脂對黑果腺肋花楸中原花青素的吸附率與解吸率如表4所示。

表4 不同大孔樹脂對黑果腺肋花楸中原花青素的吸附能力比較

2.3.2 DM130大孔樹脂動態吸附—解吸條件優化

2.3.2.1 上樣流速對大孔樹脂動態吸附能力的影響

當流出液中原花青素質量濃度達到原液中原花青素質量濃度的1/10時，即為泄漏點[12]。將流速分別設為0.5 mL·min-1、1 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2 mL·min-1、3 mL·min-1，其泄漏點分別出現在13.5 BV、11 BV、10 BV、7 BV、3.5 BV附近(圖2)。隨著上樣流速的增加，到達泄漏點時的上樣量逐漸減小。由于流速過快，會使得黑果腺肋花楸原花青素無法被大孔樹脂內表面充分吸附，導致吸附效果降低[12]；而流速過低，會大大延長實驗周期。綜合考慮，選擇2 mL·min-1作為最佳上樣流速。

圖2 上樣流速對大孔樹脂動態吸附黑果花楸原花青素的影響

2.3.2.2 上樣濃度對大孔樹脂動態吸附能力的影響

使用原花青素濃度分別為0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1 mg·mL-1的濃縮液，按照最佳上樣流速上樣，測定泄漏點。結果如圖3所示，泄漏點分別在14 BV、10 BV、6 BV。因0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1濃度低，導致上樣量變大，上樣時間變長，延長試驗周期。故選擇最佳上樣濃度為1 mg·mL-1。

圖3 上樣濃度對大孔樹脂動態吸附能力的影響

2.3.2.3 上樣量對大孔樹脂動態吸附能力的影響

按照最佳流速與最佳濃度上樣，泄漏點在6 BV(圖4)。最佳上樣流速為2 mL·min-1、最佳上樣濃度為1 mg·mL-1，最佳上樣量為6 BV。

圖4 上樣量對大孔樹脂動態吸附能力的影響

2.3.2.4 梯度洗脫

按照上述實驗確定的最佳上樣條件，上樣結束后，靜置2 h，使樹脂對原花青素充分吸附后用蒸餾水沖洗柱中雜質及未被吸附的物質，沖洗至流出液無色。分別使用4 BV的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇以2 mL·min-1流速對樹脂柱進行洗脫，收集洗脫液，測定其中原花青素含量。

圖5 不同濃度乙醇洗脫液原花青素純度

由圖5所示，50%乙醇溶液所洗脫下的流出液中原花青素含量低于40%，為了獲得純度較高的原花青素提取物，確定最佳洗脫溶液濃度為40%乙醇溶液。

按照上述優化條件確定的分離純化條件，收集洗脫液，濃縮凍干，所得提取物中原花青素純度為78.4%。

3 結論

(1)黑果腺肋花楸原花青素的最佳提取工藝方法為：提取劑是pH為3的70%的乙醇溶液，料液比為1∶15，超聲輔助提取30 min。

(2)利用DM130大孔樹脂純化黑果腺肋花楸原花青素的最佳分離純化條件：上樣流速為2 mL·min-1，上樣液濃度為1 mg·mL-1，上樣量為6 BV，上樣后靜置2 h用蒸餾水洗脫至無色，采用40%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮凍干。所得原花青素到純度為78.4%，可將原花青素大部分洗下，達到精制原花青素的效果。