正交實驗法優化超聲-微波協同提取枸杞中總黃酮的工藝研究

王琳琳，尚冀寧，徐麗娟

（銀川能源學院石油化工系，寧夏銀川750100）

枸杞是寧夏地區名貴中藥材和重要經濟作物，具有滋肝補腎、益精明目的功效[1]。枸杞一直被廣泛應用于調節免疫力、預防和降低心腦血管疾病發病率、保護肝臟、抗衰老等領域[2]。枸杞的化學成分主要為枸杞多糖、甜菜堿、色素、維生素和黃酮類化合物等活性成分[3-4]。其中，枸杞中的黃酮類化合物具有止咳、平喘、祛痰等功效[5-6]，并且具有降低膽固醇、擴張血管、增強心臟收縮能力、減少心臟搏動次數和清除身體自由基等作用，從而引起了國內外的廣泛關注[7-10]。目前對黃酮類化合物的提取方法最主要為溶劑回流提取法[11-12]、超聲波提取法[13-16]和微波提取法[17-19]。而超聲-微波協同提取法提取枸杞中的總黃酮目前尚未報道。超聲-微波協同提取法是在超聲波提取和微波提取基礎上發展的一種新型提取方法，它兼顧超聲波和微波的優點，同時又彌補各自的不足，提取過程中利用超聲波產生的強烈空化效應和微波的高選擇性等作用，可使植物細胞中的有效成分快速進入溶劑，提高有效成分的提取率，有效縮短提取時間，并且避免高溫對活性成分的破壞，因此超聲-微波協同提取技術被廣泛應用于提取植物中的生物堿、多糖、黃酮類等生物活性物質[20-23]。

通過超聲-微波協同提取技術對枸杞中總黃酮進行提取，在單因素實驗的基礎上結合正交實驗優化提取條件，得出超聲-微波提取枸杞中總黃酮的最佳提取工藝條件，并在此條件下比較乙醇回流法、超聲波提取法、微波提取法和超聲-微波協同提取法對枸杞總黃酮的提取率，為更好地開發利用枸杞中黃酮類物質提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：枸杞，寧夏百潤源生物食品有限公司。

試劑及耗材：蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇（分析純）；亞硝酸鈉（分析純）；硝酸鋁（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；CW-2000型超聲-微波協同提取儀，上海新拓測試技術有限公司；電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；UT-1950紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；DHG-9071型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-DCⅢ循環水式真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 枸杞中總黃酮的提取

將枸杞在50℃下烘干，粉碎后過50目篩；稱取過篩后樣品10 g，加入乙醇溶劑，置于超聲-微波協同提取儀中提取，抽濾、濾液為總黃酮提取液。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制

精確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.020 g，用65%的乙醇溶解，并定容于100.00 mL的容量瓶中。分別移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL置于25.00 mL容量瓶中，依次加入65%的乙醇5 mL，6%的NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min，再加入10%的Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻靜置6 min；再加入6%的NaOH溶液5 mL，用65%的乙醇定容至25.00 mL，搖勻靜置15 min。在510 nm處測定其吸光度。線性回歸方程為：A=25.963C-0.00609，R2=0.99995，在0.008～0.048 mg/mL范圍內呈良好線性關系。

1.2.3 總黃酮提取率的計算

精確移取5.0 mL總黃酮提取液置于25.00 mL容量瓶中，參照“1.2.2”進行定容，測定吸光度，根據公式（1）計算出總黃酮提取率。提取率公式為：

式中：25——測定時定容體積，mL；

V——總黃酮提取液總體積，mL；

5——測定時移取的總黃酮的體積，mL；

10000——枸杞粉末質量，mg；

A——吸光度；

0.00609 、25.963——蘆丁標準曲線系數。

1.2.4 超聲-微波提取法提取枸杞中總黃酮單因素實驗

分別設置提取功率為200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W，提取溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%，料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，提取時間為10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min條件下進行枸杞中總黃酮提取，考查提取功率、提取溫度、乙醇濃度、料液比和提取時間對提取率的影響。

1.2.5 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，對影響提取率的4個主要因素，每個因素3個水平，進行L9(34)正交實驗(表1)，優化最佳提取條件。

表1 正交實驗因素水平設計

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

按照方法“1.2.2”在510 nm下測蘆丁對照品的吸光度，并以吸光度（A）為縱坐標，蘆丁濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素實驗

2.2.1 提取功率對總黃酮提取率的影響（圖2）

圖2 提取功率對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著提取功率增大，總黃酮提取率也在增大，當功率為300 W時，提取率達到最大值，之后隨著功率增加，提取率出現下降趨勢。這種變化趨勢可能由以下原因所導致：第一，超聲波對植物細胞有破壞作用，功率小于300 W時，總黃酮有效成分溶解速度加快，故提取率增大，大于300 W后功率繼續增大，對細胞的破壞作用也增大，細胞中的雜質溶解量也相應增加，導致提取率下降；第二，微波功率增大使溶液溫度升高，當功率為350 W時，測得溶液溫度為65℃，使總黃酮中的活性成分結構被破壞而使提取率下降。因此最佳提取功率為300 W。

2.2.2 提取溫度對總黃酮提取率的影響（圖3）

圖3 提取溫度對總黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度不斷上升，總黃酮提取率也在逐漸上升。當提取溫度達到50℃時，提取率開始下降，超過50℃后，溫度升高使總黃酮中的某些不耐高溫的化合物的結構被破壞而使提取率下降，故最佳提取溫度為50℃。

2.2.3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響（圖4）

圖4 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮提取率隨之上升，當乙醇濃度為70%時，提取率最高，說明提取效果最好；之后隨著乙醇濃度進一步增大，提取率呈下降趨勢。原因可能為黃酮類化合物結構決定其具有較高極性，而不同濃度的乙醇溶劑極性不同。根據相似相溶原理，乙醇濃度為70%時與枸杞總黃酮的極性最相似，故對黃酮類化合物溶解性最強，因此最佳濃度為70%。

圖5 料液比對總黃酮提取率的影響

2.2.4 料液比對總黃酮提取率的影響（圖5）由圖5可知，隨著料液比的增大，提取率也隨之增大，當料液比達到1∶25時，提取率達到最大值，之后隨著料液比增大，提取率趨于平緩。因為隨著料液比的增大，枸杞粉末與溶劑接觸面增加，

黃酮類化合物越容易被提取出來；當料液比增大到一定值后，一定量的枸杞中總黃酮含量完全被提取出來，故提取率趨于平緩；而且，液料比增大，溶劑用量會增加，導致提取成本增高，同時也增加溶劑回收難度，使操作時間延長。因此，確定最佳料液比為1∶25。

圖6 提取時間對總黃酮提取率的影響

2.2.5 提取時間對總黃酮提取率的影響（圖6）由圖6可知，隨著時間的延長，提取率也上升。當提取時間達到25 min時，繼續延長時間，提取率有所下降，這表明提取時間達到25 min時，枸杞中的總黃酮已完全被提取出來，繼續增加提取時間，會使已提取的總黃酮部分被氧化，導致提取率下降。故最佳提取時間為25 min。

2.3 正交實驗及結果分析

L9(34)正交實驗結果見表2。由表2可知，各因素對總黃酮提取率影響的主次順序為：提取溫度(A)＞料液比(C)＞乙醇濃度(B)＞提取時間(D)，比較各因素的極差R可知，提取溫度(A)和料液比(C)的極差較大，說明這兩個因素對提取率影響較顯著；而乙醇濃度(B)和提取時間(D)的極差較小，說明這兩個因素對提取率影響較小。通過分析可以確定超聲-微波協同提取的最佳提取條件為A2B1C2D2，即提取溫度50 ℃，料液比為1∶20，乙醇濃度為60%，提取時間20 min。

表2 L9(34)正交實驗結果

2.4 驗證實驗

將優化后的最佳提取條件重復實驗3次進行驗證實驗，計算總黃酮的提取率，結果見表3。

表3 驗證結果

由表3可知，最佳提取條件所得到3組平均提取率為1.98%，RSD為0.35%，重現性較好，工藝條件合理。

2.5 方法對比

通過上述實驗及其結果分析，在最佳工藝條件下，分別采用乙醇回流法、超聲波提取法、微波提取法和超聲-微波協同提取法提取枸杞中的總黃酮，并比較提取率，結果見圖2—圖6。對比結果見圖7。

由圖7可知，對4種提取方法進行對比，得出超聲-微波協同提取法的提取率最高，達到1.98%。

圖7 不同提取方法的總黃酮提取率

3 結論

以枸杞總黃酮提取率為考查標準，采用超聲-微波提取法提取枸杞中的總黃酮。并采用正交實驗法優化提取工藝得到最佳提取條件。最佳提取條件為：提取功率300 W，提取溫度50℃，乙醇濃度60%，料液比1∶20，提取時間20 min；由此條件的驗證實驗得出提取率為1.98%。并在最佳條件下比較4種提取方法的提取率，得出超聲-微波協同提取法總黃酮提取率最高。該實驗結果為高效合理開發枸杞中的活性成分提供了一定的理論基礎。