五糧液包包曲發酵過程中的揮發性成分

楊康卓，趙 東，鄭 佳，張建敏，劉 芳

（宜賓五糧液股份有限公司技術研究中心，四川宜賓644007）

大曲是白酒發酵的糖化劑和發酵劑，同時，培曲過程中由于微生物代謝產生的大量風味物質及相關前體物質在拌和酒醅、發酵過程中直接或間接進入酒醅，經酒醅發酵、蒸餾后會顯著影響產品的香味風格特征，因此大曲也是一種生香劑[1]。五糧液生產使用的“包包曲”，屬濃香型大曲，按品溫來劃分則為中偏高溫大曲。它是以粉碎的純小麥為原料，壓制成帶有鼓包形狀的磚塊狀曲坯，在一定溫度及濕度條件下發酵而成的，具有獨特的香氣特征[2]。

固相微萃取-氣質聯用技術(SPME-GC/MS)是目前研究大曲揮發性組分的最常用的方法。范文來等[3]在濃香型大曲中檢出了112種微量揮發性組分；陳勇等[4]在瀘州老窖高溫大曲中檢出了34種揮發性組分；趙東等[5]從五糧液包包曲中定性出68種揮發性成分，主要以雜環類化合物為主。但是，由于包包曲制曲過程是一個動態的過程，制曲過程中香氣成分往往隨著微生物群落結構的演替而發生顯著的變化，因此，研究發酵過程曲坯中香氣成分的變遷規律對調節工藝參數、改善曲塊質量具有重要現實意義。

本研究利用SPME-GC/MS技術分析了包包曲發酵過程中的揮發性成分，結合質譜匹配度、保留指數和標準物質等進行成分的定性，獲得了較為全面的五糧液“包包曲”揮發性成分數據庫，為大曲質量標準的建立和探討大曲對酒質的影響提供了數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

包包曲樣品采集自五糧液股份有限公司制曲車間，分別取發酵期為0 d、3 d、7 d、14 d、30 d(即發酵完成后出房的成品曲)的大曲樣品。所有樣品在實驗室粉碎混勻，制成曲粉于-20℃下保存。

1.1.2 試劑和儀器

C7—C30直鏈正構烷烴、3-甲基-3-己醇、3-苯基-2-丁烯醛、萘、2-甲基吡嗪，購自美國Sigma-Aldrich公司。(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-己二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛,(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、己醛、壬醛、癸醛、乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、(E)-2-己烯酸己酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、琥珀酸乙酯、十一酸乙酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十五烷酸乙酯、棕櫚酸乙酯、十七酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、4-辛酮、乙偶姻、異丁醇、異戊醇、己醇、1-辛烯-3-醇、庚醇、正辛醇、2,4-己二烯-1-醇,苯甲醛、苯乙醛、苯甲酸乙酯、苯乙酸甲酯、苯乙酸乙酯、愈創木酚、苯丙酸乙酯、苯乙醇、3-苯基-2-丁烯醛、苯酚、4-乙基愈創木酚、甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-戊基呋喃、糠醛、糠醇、β-石竹烯、乙酸、己酸、γ-丁內酯、γ-己內酯、γ-壬內酯，購自TCI(上海)公司。

固相微萃取手柄和50 μm CAR/DVB/PDMS纖維萃取頭，購自美國Supelco公司。氣質聯用儀為7890B-977B，購自美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 萃取頭老化

各類型萃取頭在首次使用之前均需要在熱條件下老化，老化程序參考Supelco配件盒內老化指南。

1.2.2 萃取條件

稱取1 g大曲粉于20 mL頂空樣品瓶中，置于60℃水浴中平衡15 min，插入萃取頭吸附揮發性成分40 min，隨后插入GC進樣口熱解析3 min，分析其中揮發性成分。

1.3 GC-MS條件

利用配備了極性色譜柱DB-WAX(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)的GC-MS分析包包曲粉中的揮發性成分。

氣相色譜條件：進樣口溫度250℃，載氣(He)流速1 mL/min，不分流模式進樣；氣相色譜升溫程序：起始爐溫40℃，保持5 min，以4℃/min升至230℃，保持15 min。

質譜條件：質譜EI源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度200℃，四級桿溫度150℃，質量數掃描范圍35～350 amu。

1.4 物質鑒定

揮發性成分的鑒定采用參考文獻[6]的方法：即先將化合物與NIST08標準數據庫進行比對，匹配度＞800(最大值1000)，作為初步定性結果；再計算各物質的Kovats保留指數(RI)[7]，并與文獻報道的保留指數值進行比較。同時，與標準品在相同色譜條件下的保留時間對比，最終確定該物質的歸屬。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時期包包曲揮發性成分總離子流圖（見圖1）

本研究分析了包包曲發酵過程中的揮發性成分（圖1），共鑒定出137種揮發性成分，其中醛類19種、酯類40種、酮類8種、醇類15種、芳香族22種、吡嗪類12種、呋喃類7種、酸類3種、內酯類3種、萜烯6種、其他物質2種。

2.2 醛類（表1）

由表1所示，共檢出醛類化合物19種，其中不飽和醛最多(14種)，其次為直鏈飽和醛(4種)和支鏈飽和醛(1種)。

不飽和醛包括(E)-2-丁烯醛、2-甲基-戊烯醛、3-甲基-2-丁烯醛、2-乙烯基-2-丁烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-己二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、2,4,6-辛三烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、2-十一烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、5-乙基-1-環戊烯基-1-甲醛。其中，3-甲基-2-丁烯醛、2-乙烯基-2-丁烯醛、2-十一烯醛、2,4,6-辛三烯醛屬首次在濃香型大曲中檢出。

單不飽和醛多具有類似青草、蘑菇味，如(Z)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛具有顯著的蘑菇味、霉味，可能與包包曲驗收過程中所謂的“菌香”有一定關聯性。多不飽和醛類(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛，表現為典型的油脂與青草復合香氣。

直鏈飽和醛包括乙醛、己醛、壬醛、癸醛。這4種直鏈飽和醛在大曲發酵過程和成品中都能檢出。乙醛極易揮發，具有刺激性氣味。己醛具有顯著的青草味，氣味閾值為17 μg/L。壬醛和癸醛具有醛香味，氣味閾值分別為1 μg/L和6 μg/L。此外，這些直鏈飽和醛也在濃香型白酒中被全部檢出。

支鏈飽和醛僅有甲硫基丙醛1種。甲硫基丙醛呈現強烈的洋蔥味和肉腥味，其僅在大曲發酵的前期過程中發現，成品大曲中沒有檢出。

圖1 不同發酵時期包包曲揮發性成分總離子流圖

2.3 酯類（表2）

如表2所示，共檢出酯類化合物共40種，其中直鏈飽和酯最多(21種)，其次為不飽和酯(11種)和支鏈飽和酯(8種)。

表1 大曲中醛類化合物

9-壬酮酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、甲氧基乙酸異戊酯、12-甲基-十三烷酸甲酯、13-甲基十四烷酸乙酯、15-甲基-棕櫚酸乙酯、(E)-2-己烯酸己酯、12,15-辛二烯酸甲酯、(3E)-3-壬烯酸乙酯、肉豆蔻烯酸乙酯、(Z)-9-十五烯酸乙酯、9,12-十六碳二烯酸乙酯、(Z)-9-十七烯酸乙酯等13種酯類在濃香型大曲揮發性物質的研究中首次發現。

表2 大曲中酯類化合物

飽和酯類多呈現水果味，且大部分在濃香型白酒中已經被檢出。而不飽和酯類物質對于大曲香味的貢獻還不清楚，需以后進一步探討。

2.4 酮類（表3）

如表3所示，共檢出酮類化合物8種，其中飽和酮4種，不飽和酮2種，環酮1種，羥酮1種。

在本次研究中，飽和酮2-辛酮、2-十一烷酮和不飽和酮6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙偶姻在濃香型白酒中均有檢出。而(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮是首次在濃香型大曲中發現，其呈現辛辣味道，氣味閾值為150 μg/L。

2.5 醇類（表4）

如表4所示，共檢出15種醇類化合物，其中不飽和醇5種，直鏈醇3種，支鏈醇3種，環狀醇2種和多元醇2種。

本次研究中有8種醇類物質在中高溫大曲中均有檢出，且異戊醇、正己醇的含量在醇類中最高[20]。3-甲基-2-丁烯-1-醇具有典型的金屬味、酚味，其在發酵前期含量較高，直至發酵結束時逐漸減少，說明其可能是大曲發酵中的一種過程產物[15]。1-辛烯-3-醇具有強烈的蘑菇味和土腥味，閾值為2.7 μg/L。(E)-2-壬烯-1-醇、2,4-己二烯-1-醇分別呈現脂肪味和新鮮蔬菜味，此前在其他濃香型大曲揮發性物質研究中也有檢出。

2,3-丁二醇在濃香型白酒和大曲中均有發現，主要呈現黃油和奶油的香氣。本次研究定性了2,3-丁二醇的兩種異構體([R-(R*,R*)]-2,3-丁二醇、[S-(R*,R*)]-2,3-丁二醇)，而兩種異構體對大曲香氣的影響還沒有相關報道，需進一步探討。

2.6 芳香族類（表5）

表3 大曲中酮類化合物

表4 大曲中醇類化合物

如表5所示，本次研究共檢出22種芳香族化合物，其中芳香酯類5種，芳香醇類4種，芳香醛類3種，酚類4種，萘類2種，烷基苯類2種，噻唑類2種。其中3-苯基-2-丁烯醛、1,5-二甲基萘、2-苯基-1-丁醇、1-甲基-3苯基丙烯醇是首次在濃香型大曲中發現，其他大部分物質在濃香型大曲[3，14，21]和白酒[13，22]中均有檢出。

芳香族化合物多數具有花香、甜香味。其中苯乙醇、愈創木酚被認為是優質濃香型大曲的主要香味成分，而苯甲醛、苯甲醇為優質濃香型大曲香味體系的組成部分[24]。酚類物質具有特殊氣味，其中苯酚呈現為一種刺激性氣味，4-乙基愈創木酚呈現為辛辣味和藥味，2-乙烯基愈創木酚呈現為木材味和煙熏味，它們的氣味閾值分別為5.5 mg/L、25 μg/L、3 μg/L。

表5 大曲中芳香族類化合物

表6 大曲中吡嗪類化合物

2.7 吡嗪類物質（表6）

如表6所示，本次研究共檢出12種吡嗪類化合物,均在濃香型白酒中檢出。此次研究中檢出的吡嗪類化合物多呈現出堅果味、烘培味、巧克力味，其主要在大曲發酵過程后期(降溫期)產生[24]，與高溫下的美拉德反應和微生物代謝合成作用有關。2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪被認為是中高溫曲中的重要香氣物質[21]，氣味閾值分別為800 μg/L和200 μg/L。

2.8 呋喃類化合物（表7）

如表7所示，本次研究共檢出7種呋喃類化合物。2-戊基呋喃、糠醛、糠醇是重要的呋喃類化合物，在白酒中已經檢測到[13]。2-戊基呋喃呈青豆味、金屬味，糠醛呈面包味、霉味，糠醇呈水果味，它們的氣體閾值分別為6 μg/L、3 mg/L、2 mg/L。有研究表明，2-戊基呋喃、糠醛在發酵的升溫階段是主要的化合物，有很高的濃度[24]。

2.9 萜烯類化合物（表8）

表7 大曲中呋喃類化合物

表8 大曲中萜烯類化合物

表9 大曲中酸類、內酯類化合物

本研究中共檢出6種萜烯類化合物（表8），其中α-古云烯、長葉烯、順-羅漢柏烯、韋得醇這4種化合物是首次在濃香型大曲中發現。α-古云烯在是芒果揮發油的主要成分[25]，且有研究表明含α-古云烯的揮發油有鎮靜效果[26]。γ-欖香烯在溫莪術的揮發油中被分離出來，具有抗癌活性[27]。β-石竹烯呈現木材味、丁香味，在其他大曲揮發性物質的研究中也有發現，具有治療結腸炎、鎮咳等作用[28]。

2.10 酸類、內酯類化合物（表9）

由表9所示，本研究一共發現了3種酸類化合物、3種內酯類化合物。

乙酸呈醋味、酸味，己酸呈汗臭味。γ-丁內酯、γ-己內酯、γ-壬內酯主要呈甜香味、奶香味。這5種化合物均在濃香型白酒中檢出。

2.11 其他類化合物（表10）

由表10所示，本次研究中還發現了1種烴類化合物、1種雜環類化合物。其中2-乙酰吡咯具有堅果味，但閾值較高。

表10 大曲中其他類化合物

3 結論

本次研究利用HS-SPME-GC-MS技術從五糧液包包曲中共檢測出揮發性化合物137種，其中有26種物質系首次在濃香型大曲中發現。下一步我們將逐步對這些鑒定出來的揮發性物質進行定量，進一步探索五糧液“包包曲”的香氣構成及香氣活性物質。